Microbieel Ecologische Systemen
Door Prof. Dr. ir. Nico Boon & Jo De Vrieze
DEEL A: SITUERING VAN MICROBIËLE GEMEENSCHAPPEN
HOOFDSTUK I – MICROBIOTA: FUNCTIONEEL OVERZICHT
1. Situering van de microbiota
1.1. De fylogenetische boom
Op basis van 16S of 18S ribosomaal RNA wordt het leven ingedeeld in 3 domeinen
Archaea
▪ Archaea lijken in vorm/werking sterk op Bacteria maar zijn heel verschillend van de andere 2 obv rRNA
o Membraanlipiden uit ether-bindingen Bacteria uit ester-bindingen
▪ Kunnen leven/overleven extreme en energie-arme omstandigheden
o Door speciale cel-samenstelling + speciale metabole pathways
Bacteria
▪ 2 fylogenetische groepen erg belangrijk
o Proteobacteriën = purper bacteriën
▪ Verder onderverdeeld obv 16S rRNA in 5 groepen (𝛼, 𝛽, 𝛾, 𝜃, 𝜀)
o Gram positieve bacteriën
▪ Celwand is arm aan lipiden
▪ Kunnen sterk zure omstandigheden doorstaan
▪ Gunstige en soms schadelijke eigenschappen
Opmerkingen:
▪ Protozoa en schimmels zijn MO maar nauw verwant aan planten en dieren
▪ Biologisch leven (deloof 1996)
o Compartiment met vermogen te communiceren met interne en externe (omgeving) structuren
o Het compartiment kan groeien door dissepatie van energie, te vermenigvuldigen en steeds te functioneren
→ door fouten die ontstaan/gemaakt worden ontstaan nieuwe betere vormen van levende materie
1.2. Omschrijving micro- en macrobiota
1.3. Outside vs inside microbiota
Microbiële wereld = continuüm waarbij voortdurend wisselwerking is tussen dode en levende materie
▪ Outside microbiota = in de vrije omgeving (bodem, water, lucht) → hierop gefocust in de cursus met referentie naar inside
▪ Inside microbiota = geassocieerd met waardorganismen (planten, dieren)
,1.4. Theoretische concepten over de microbiële ecologie
Twee hoofdtheoriën verklaren de aanwezigheid van soorten
1. Niche-theorie: Darwin
a. Soorten coëxisteren door unieke anapassingen aan specifieke omgevingsfactoren = niche-specialisatie
b. Milieu selecteer de beste soort en bepaalt wie er groeit, deze zal de niche innemen (bepaalde taak uitvoeren)
2. Neutrale theorie: Hubbell
a. Soorten zijn ecologisch gelijkwaardig en diversiteit ontstaan door willekeurige processen (migratie, uitsterven, …)
b. Soortenrijkdom en abundantie in gemeenschappen wordt verklaar door neutrale verschillen tussen soorten
c. Door constante flcx van komende en gaande species zorgt voor voortdurende nieuwe kansen en functies binnen de
gemeenschap van MO
Belangrijke concepten
▪ Multicellulariteit
= MO kunnen een los mengsel zijn, elk onafhankelijk van elkaar maar kunnen zich ook organiseren tot een soort multigenoom
systeem (verschillende MO samen) → samenwerking:
o Transfer van genen tussen organismen
o Cross-feeding tussen cellen
o Opbouw van 3D structuren o.a. kanalen
o Cellulaire differentiatie → sommige oudere cellen vermeerderen niet meer maar onderhouden de jongeren wel)
▪ Redundantie
= een grote diversiteit aan species is nodig om een taak te volbrengen (vb. 70tal #MO voor afbraak beukenblad
= aantal sleutel-species en veel figuranten voor de taak
o Relatie soortenrijkdom en functionaliteit ecosysteem → complementariteitsmechanisme
▪ Soorten dragen evenveel bij aan functionaliteit en zijn complementair (andere taken)
▪ Sommigen of meerdere doen dezelfde functie en zijn functioneel overbodig
→ zorgt wel voor een buffer in het ecosysteem
▪ Co-evolutie
o MO zijn voortduren in co-evolutie met elkaar = ze evolueren samen
o MO co-evolueren ook voortdurende met hogere organismen, ze adapteren aan hogere planten/dieren en visa versa
o Black-queen hypothesis
▪ Theorie die verklaart waarom MO vaak afhankelijk zijn van elkaar voor essentiële functies
▪ Black queen: kostbare maar, lekkende functies wordt slechts door een paar organismen gedaan
→ afbreken toxine bv
▪ Cheaters: zij stoppen met het uitvoeren van deze functie omdat ze profiteren van de bijdrage van andere
▪ Dit leidt tot een taakverdeling binnen de gemeenschap, waarbij de productieve individuen vastzitten in hun
rol, wat co-evolutie en zelfs de evolutie van nieuwe functies mogelijk maakt
▪ Krijgt dus specialisatie binnen een soort → risico! Want al 1 schakel wegvalt → berusten op elkaar
▪ Microbiële hubs
o MO werken in serie: complex substraat → eenvoudige metabolieten met hierin vitale knooppunten = hubs
o Indien een van de schakels getroffen wordt → sterke terugval van functionaliteit
▪ MRM: Microbial Resource Managment
o Microbiële gemeenschap wordt beschouwd als een bedrijf dat gemanaged en gestuurd kan worden en zo de
capaciteiten van de microbiële mengculturen in de gemeenschap goed te organiseren
o Moet hiervoor wel inzicht verkrijgen in het multigenoom van de microbiële gemeenschap
▪ Welke species (genen?), wie doet wat, hoe interageren ze en zorgen ze voor expressie van genen van anderen,
hoe sterk veranderd de dynamiek? (traag = evolutie, rap = chaos, verstoring), is er een zekere graad van
leiderschap
, o MRM wordt doorgevoerd obv 3 pa rameters
▪ Rr Range weighed richness index = verscheidenheid aan genen/species in de gemeenschap
→ berekend uit aantal streepjes aanwezig in DGGE barcode
▪ Dy Dynamiek van species → verschuiving van 20% van species per week = normale dynamiek
→ berekend via bewegend venster analyse, samenstelling gemeenschap steeds getoetst
▪ Co Community organisation = geeft organisatie gemeenschap weer (gelijkheid)
→ species gelijk in waarde/betekenis in gemeenschap?
o Ja? → complete eveness
▪ Gemeenschap kan snel aanpassen aan nieuwe omstandigheden
▪ Wel niet georganiseerd (al lemaal gelijk) → gevoelig voor infectie
o Pareto-toestand
▪ Normaal evolueert gemeenschap hiernaartoe
▪ 20% van species vervullen 80% van de taken
▪ Functionele toestand maar totale ineenstorting bij felle stress
2. Algemeen overzicht van microbiota werkzaam in de bodem
Hieronder volgt een overzicht van de belangrijskte 6 groepen MO werkzaam in de bodem + hun kenmerken
2.1. Bacteriën / Archaea (domein 1-2)
Metabolisch de meest diverse groep (zowel anaeroob als aeroob, autotroof als heterotroof) dat cruciaal zijn voor de C, N, S, P-cycli
Groei De meesten zijn organotroof = leven van organische verbindingen (heterotroof)
Sommigen zijn chemolithotroof = energiebron is een redoxreactie (autotroof)
Vermenigvuldiging gebeurt meestal door dwarse deling (klonen), seksuele interacties meestal in geval van stress
1. Soorten energiebronnen
▪ Nitrificatie + oef
o Belang waterzuivering
o Autotrofen
o AOB = ammoniak-oxiderende bacteriën
o AOA = ammoniak-oxiderende archaea
o NOB = nitriet-oxiderende bacteriën
o Eenstaps nitrificatie → geen AOB/AOA
▪ Zwavel oxidatie + oef
o Vorming zwavelzuur
o Praktisch probleem zwavelzuur in riool → sewer corrosion = betonrot
▪ IJzer oxidatie: biologisch roesten ijzer
▪ HOB: hot topic voor microbieel eiwit
▪ H2 + CO2
o Hydrogenatiereactie
o Uitgevoerd door hydrogenotrofe methanogenen (archaea!)
K-strateeg → autochtoon
Groeien zeer traag en lange generatietijd
Fysiologisch optimaal aangepast aan hun specifieke niche
Grote affiniteit voor voedsel (Ks = laag) dus kunnen bij lage concentraties
ook voedsel opnemen
r-strateeg → zymogeen
Opportunisten die explosief groeien zodra er veel makkelijk voedsel beschikbaar is
, 2. Onderverdeling naar type waterstof-acceptor (elektron) dat ze kunnen benuttigen
Redoxpotpotentiaal (Eh) > 0 → aëroob of oxisch milieu
Redoxpotentiaal (Eh) < 0 → anaëroob of anoxische molieu
▪ Respiratie = O2 of anorganische component als electronen-acceptor
▪ Fermentatie = organische molecule als electorenacceptor
3. Nutriëntenvereiste bodembacteriën
85% van de bodembacteriën heeft 1 of meer groeifactoren (AZ, vitaminen, bodemextract) nodig voordat ze groeien
Ecologie ▪ 105-108/g grond
▪ Voorkeur vochtige grond en met hoog gehalte organisch materiaal
▪ Ingedeeld in
o Autochtone bodembacteriën = stabiele populatie, afstamming populaties die al lang op die specifieke
plaats voorkomen, humusafbrekers (Arthrobacter), K-strateeg
o Zymogene bodembacteriën = snelle groeiers bij hoge organische influx (Bacillus), r-strateeg
Betekenis ▪ Ze zijn cruciaal zijn voor de C, N, S, P-cycli
▪ Autochtone zorgen voor humusmineralisatie → nutriënten voor planten
▪ Exclusieve rol fixatie N2 en denitrificatie NO3-
▪ Vrijwel alleenheersers in anaërobe gronden
▪ Sommige pathogenen = tellurische pathogenen = ziekteverwekkers die leven in de bodem
o Plant: zachtrot, kankers (Agrobacterium)
o Mens en dier: anthrax, tetanos
Telling 2 methodes
1. Rechtstreek: microscopie en telkamer
2. Onrechtstreeks
a. Uitplating op vaste agarbodem + CFU bepalen
b. Proefbuis
c. Moleculaire technieken → verder
Belangrijke opmerking
Voor de groei van autochtone bacteriën is nutriëntarm medium vereist, nutriëntrijk voor opkweek zymogene species
2.2. Actinomyceten
Actinomyceten = draadvormige bacteriën (gram-positief) ( niet laten misleiden door ‘myceten’, het zijn geen fungi) (domein: Bacteria)
▪ Produceren antibiotica en geosmine (grondgeur)
▪ Tolerant voor droogte
▪ Gespecialiseerd in de afbraak van complexe, resistente organische verbindingen (bio-remidiatie)
Groei Organotroof (an)aeroob
Ecologie ▪ 105-108 grond
▪ 10-50% van biomassa vruchtbare grond
▪ Bevoordeeld in droge grond → zijn droogtetolerant → hun conidiën weerstaan vlot de droogte
▪ Benadeeld in zure grond → fysiologisch zwak onder pH 5
, Betekenis Ze spelen een zeer belangrijke rol en ze komen in grote aantallen voor, daarom apart van bacteriën besproken
1. Ontbinding van resistente componenten (trage groeiers, wel enzymatisch potentieel) → bv chitine afbraak
2. Boven 40°C komen enkel nog actinomyceten en sporenvormende bacteriën voor (composthoop)
3. Produceren geosmine
4. Zorgen voor humusvorming: mycelium van actinomyceten beat tal van aromatische componenten (zie verder)
5. Bodemhomeostasis: produceren belangrijke antibiotica (hieronder kenmerken antibiotica algemeen)
a. Beïnvloeden groei van MO negatief (geproduceerd ook door MO)
b. Werken in op verschillende chemische-structuren (lactonring, nitro-verbinding, polypeptide, …)
c. Variërend spectra
i. Tegen G-: streptomycine → inhibitie van eiwitsynthese
ii. Tegen G+: penicilline → inhibitie van celwandsynthese
iii. Tegen beide: tetracycline
iv. Tegen fungi: actidione, antamycine
v. Bacitracine, chlooramfenicol → inhibitie van celmebraanwerking
6. Ziekteverwerkers
a. Plantenziektes zoals aardappelschurft
b. Mens en dier
i. Nocardia asteroïdes → nocardiosis: groei van mycelium in longen/nieren als gevolg van
verminderd weerstandsvermogen, contaminatie via grond en stof
7. Belang in N-fixatie: sommigen vormen nodulen op niet-leguminosen
Telling ▪ Rechtstreeks: microscopie van telkamer
▪ Onrechtstreeks: agarplaat
o Selectieve: toevoeging speciaal substraat (chitine) of remstoffen (actidione → tegen fungi)
o Niet-selectief: differentiatie obv kolonie uitzicht en geur
2.3. Fungi
▪ Vormen myceliumnetwerken
▪ Breken lignine en cellulose af
▪ Zorgen voor de bodemstructuur
▪ Domineren in zure en droge omstandigheden
Groei Organotroof aeroob
Ecologie ▪ In A-horizon (0-30cm diep)
▪ 10 – 100m! mycelium/g grond
▪ Bevoordeeld door
o Hoge concentratie organisch material
o Hoge O2-concentratie
o Hoog vochtgehalte
o Lage pH → pH 2-5 geeft hen monopolie
▪ Dominantie van bepaald species van fungi is ster afhankelijk van het plantenbestand
▪ Temperatuur
o Max tot 40°C
o Warme regio → Aspergillus en Trichoderma zijn dominant
o Koude regio → Mucor en Penicillium zijn dominant
▪ Overleven meerdere jaren in bodem dmv sclerotia (bundel van mycelium)
Betekenis 1. Afbraak organisch materiaal → zeer sterke enzymatische activiteit (cellulose, lignine, hemicellulose, …)
2. Hogere fungi: asco- en basidiomyceten → voeden zich met wortelexudasen van grassen/houtachtige gewassen
a. Belang in voeding (paddenstoel), geneesmiddelen, toxicologie
, b. Bodemevaluatie: stinkzwam → humusrijk vliegenzwam → zure grond
c. MER = Milieu effect rapportering → bij Pb-pollutie (lood) verdwijnt Hanekam
3. Bijdrage bodemstabiliteit
4. Bijdrage humusvorming via synthese melanine en chitine → blijven na sterfte achter in bodem als humus
5. Directe interactie met planten
a. Negatief: plantenpathogene schimmels
b. Positief: mycorrhizen (zie verder)
6. Predeteren op nematoden door afscheiden enzymen die de nematoden ‘oplossen’
7. Infectie en intoxicatie (negatief)
a. Groeit op gewas → veevoeder → Aspergillus flavus → aflatoxine (schade dier/mens)
b. Schimmel op groeiend gras → Pithomyces chartarum → sterfte schapen in Nieuw-Zeeland
Telling ▪ Rechtstreeks: kleuren en opmeten van mycelium onder microscoop
▪ Onrechtstreeks: uitplating op selectieve agarbodems (hoge [nutriënt], lage pH, bacteriële remstof (streptomyc bv)
Bepaling v Hoeveelheid fungale biomassa kan selectief bepaald worden door extractie van ergosterol, een typische fungale
biomassa component → bepaling via HPLC (High Performance Liquid Chromatography)
2.4. Protozoa
▪ Grazen op bacteriën (‘regulators’)
▪ Houden bacteriële populatie jong en actief
▪ Versnellen nutriëntenkringlopen
Groei 3 types te onderscheiden (aeroob/anaeroob/facultatief komen voor)
▪ Foto- en lithotroof → licht + mineralen
▪ Organotroof en saprofaag → opname organisch materiaal in oplossing
▪ Organotroof en fagotroof → opname organisch materiaal in particuliere vorm
(biofaag als er levende bacteriën opgenomen worden)
Ecologie ▪ Bovenste cm van bodem
▪ 104-105/g grond
▪ Voorkeur vochtige gronden met veel organisch materiaal
▪ Bij ongunstige condities → snel cyste vorming = overlevingstechniek
Betekenis 1. Ziekteverwekkers
a. Amoeba: dysenterie, hersenvliesontsteking
b. Flagellata: slaapziekte
c. Sporozoa: malaria
2. Potentieel belangrijk voor verspreiden bacteriën zoals nitrificeerders in bodem
a. Door bv verspreiden van nitrificeerders (minder mobiel in bodem), protozoa = transportmiddel
b. Case: Legionella pneumophila → protozoa bevorderen deze op 3 manieren (1) necrotrofie aangezien
Lp op dode protozoa kan voeden of het als gastheer kan gebruiken (2) verspreiding, als Lp
opgenomen wordt, wordt hij niet verteerd en rijst het mee, (3) activatie van Lp in de protozoa →
wordt virulenter
3. Regulatie bacteriële densiteit via grazen
a. 103! Bacteriën nodig voor opbouw 1 protozoale cel (105/g grond < bacteriële densiteit nodig)
b. Ze grazen selectief → voorkeursprooien, andere worden veel minder of totaal niet benuttigd
4. Versnellen kringlopen van nutriënten (zie verder)
5. Actief houden van de bacteriën
a. In aquatische milieu’s predateren protozoa zeer actief op bacteriën → 17% van metabolisch actieve
bacteriën begraasd per dag (60% van die biomassa ingebouwd in protozoa)
→ houdt bacteriële gemeenschap jong, actief en competitief
b. Gemeten via pulse-chase labelling + oef → concept goed doorhebben
, i. Pulse (Merken): Aan een waterstaal worden radioactief gemerkte stoffen (3H-thymidine en
14
leucine) toegevoegd. De bacteriën nemen deze op in hun DNA en eiwitten
ii. Chase (Verdunnen): Na een korte tijd voegt men een enorme overdosis (500x) niet-
radioactieve stoffen toe. Hierdoor stopt de opname van radioactiviteit, maar de bacteriën
blijven normaal doorgroeien. De bacteriën zijn nu "gelabeld"
iii. Incubatie en Meting: Het staal wordt geïncubeerd zodat protozoa de gemerkte bacteriën
kunnen opeten. Via filtratie scheidt men de protozoa van de bacteriën en meet men de
radioactiviteit in de protozoa → zegt hoeveel is opgegeten en hoeveel biomassa erin zit
Telling ▪ Rechtstreeks: microscopie (cystes goed te zien onder microscoop → zie vroeger Paramecium)
▪ Onrechtstreeks: agarplaat ingezaaid met prooi-bacteriën → observatie van klaringszones
2.5. Algen
▪ Fotolithotroof
▪ Pioniers op kale gronden
▪ Sommigen (cyanobacteriën) fixeren stikstof
Groei Fototroof en lithotroof → licht + mineralen
Ecologie ▪ In bovenste cm: 500-5000 cellen/g grond, soms 1m diep
▪ Bevoordeling bij vochtige en braakliggende gronden
o Blauwgroene algen en kiezelwieren → neutrale tot licht alkalische gronden
o Groene algen → zure gronden
Betekenis ▪ Rijst paddies
o N-fixatie door blauwgroen algen
o Aëreatie van de waterlaag → zelfreinigend vermogen vijvers → oef
▪ Braakliggende gronden
o Beperken erosie
o Pioniers initiatie van kolonisatie → algen en korstmossen op vulkanische en platgebrande gronden
▪ Rotsen → langzame erosie door organische zuren
Telling ▪ Rechtstreeks: telling onder microscoop of extractie chlorofyl uit bodem met solvent
▪ Onrechtstreeks: meest waarschijnlijke aantallen (MWA) in mineraal vloeibaar medium
2.6. Virussen
▪ Parasiteren op alle levensvormen
▪ Zorgen via het ‘kill the winner’-principe voor diversiteit en mediëren gentransfer
Groei en morfologie Ze benuttigen de reserves als enzymatische mechanismen van de waardcel
Vermenigvuldiging komt enkel voor in jonge cellen
Verschillende levensfasen (virulent/getemperd), verschillende vormen en (DNA/RNA met of zonder mantel)
Ecologie Ze komen massaal voor in het milieu → bv 108/ml zeewater
1. Kunnen zowat alle levensvormen infecteren
2. Verspreiding in bodem via micro- en macroorganismen (nematoden belangrijk – 50% meercel dieren)
3. Overleving in bodem sterk afhankelijk van milieufactoren
a. Watergehalte, pH, humusgehalte
b. Voor alle 3 geldt: hoe lager, hoe sneller inactivatie
Betekenis ▪ Hun rol in natuur is nog niet duidelijk, ze zorgen wel voor kill-the-winner (KtW) → ze houden meest
succesvolle MO onder controle want groeien best, krijgt voortdurend verschuiving in top-species en zo
komen redundante species ook aan bod
, ▪ Verwekken ziektes bij mens, plant, dier
▪ Ondermijnen van geënte bacteriën zoals Rhizobium (zie verder), plantengroei bevorderende bacteriën
(PGPB)
▪ Transductie van genetisch materiaal (R-factoren)
▪ Eventueel alternatief voor antibiotica, selectiviteit: ontsmettingsproduct
3. Microbiële densiteit
3.1. Telling van het aantal propagulen → cellen/mL
Propagule = elk deel of structuur van een organisme (zaad, spoor, cel, …) dat kan dienen voor voortplanting en verspreiding naar een
nieuwe locatie zodat het kan uitgroeien tot een nieuw individu of een nieuwe kolonie = voortplanting/verspreidingsseenheid
Directe telling (tijdrovend)
▪ Elektronenmicroscoop of lichtmicroscoop of fluorescentiemicroscoop
▪ Telraam
▪ Gebruik van functionele kleurstoffen → kan levende cellen herkennen
o Bv DNA kleurstoffen → binden DNA → alles dat oplicht is bacterie/virus
o Bv kleurstof dat fluoresceert na enzymatische afbraak → voornamelijk opsporen levend schimmelmycelium
▪ Bv FDA = fluoresceïne diacetaat
Indirecte telling (fouten, dispersie, openbreken)
▪ Vergt cultivatiestap (uitplaten, al dan niet selectief) op vaste voedingsbodem of in vloeibaar medium
o Vaste voedingsbodem → aard van medium ook grote impact op resolutie (tabel)
▪ Grond-agar
▪ Voedingsagar
o Vloeibaar voedingsmedium
▪ Aanleggen van een MWA (meest waarschijnlijke aantallen)
• Je maakt een seriële verdunning (10-1, 10-2, … bv)
• Je inoculeert per verdunning 3 of 5 buisjes, elk buisje bevat geschikt groeimedium
• Je incubeert onder juiste omstandigheden
o Groei = positief (troebelheid, gas, kleurreactie)
o Geen groei = negatief
• MWA bepalen via tabel
o In voorbeeld heb je 5 – 2 – 0 resultaat
o Betekent dat tweede verdunning rond detectiegrens van MWA zit
o Via tabel dan 5-2-0 code omzetten naar WMA = geschat aantal
• Dan concentratie berekenen
o MWA * inverse van tweede verdunning = MWA*102 cellen/mL
▪ MWA typisch gebruikt voor waterkwaliteit na te gaan
▪ Ook handige techniek om algen of nitrificerende bacteriën aantal te bepalen → groeien niet graag op agar
Het aanleggen van een MWA-bepaling houdt in dat men seriële verdunningen van een staal inoculeert in
meerdere buisjes, de aanwezigheid van groei registreert en via statistische tabellen het meest waarschijnlijke
aantal micro-organismen bepaalt.
Elektronenmicroscoop detecteert 109 N/g (N = partikels) andere microscopen
factor 100 lager uitplating vast voedingsmedium nog eens factor 100-1000
lager
→ die hebben dus een veel lagere resolutie dan de elektronenmicroscoop en zullen bv alle virussen gemist hebben
, 90% is dus dood, 10% levend wat van groot belang vormt voor de gebruikte
analysetechniek voor het #progranules te bepalen
→ afvragen moeten we levende/dode of alles hebben
→ bv fluorescentie onderscheiding maken
3.2. Bepaling van de biomassa → cel droge of C gewicht/L
De levende biomassa (ca 500 mg C/kg grond) is een tactische reserve voor nutriënten (N, P) en katalysator voor omzettingen
Belangrijk om te weten
Belangrijke concepten
𝝆 ha = 10 000 m²
▪ Soortelijk gewicht [ 𝝆 𝒔𝒕𝒐𝒇 ]
𝒘𝒂𝒕𝒆𝒓 1,25 x 1012 bact = 1g biomassa DS
o Dimensieloze eenheid 1 m mycelium draad = 1µg biomassa DS
o Geeft aan hoe zwaar een stof is in vergelijking met water 1 km mycelium draad = 1 g biomassa DS
o Water bij 4°C → 𝜌 = 1, dus als soortelijk gewicht van een stof > 1 zal het zinken
o Aangezien 𝜌𝑤𝑎𝑡𝑒𝑟 = 1 → soorteloijk gewicht = dichtheid met kg/dm³ erbij gezet
𝒎𝒂𝒔𝒔𝒂 𝒏𝒂 𝒅𝒓𝒐𝒈𝒆𝒏
▪ Droge stof-gehalte (%) [ 𝒐𝒐𝒓𝒔𝒑𝒓𝒐𝒏𝒌𝒆𝒍𝒊𝒋𝒌𝒆 𝒎𝒂𝒔𝒔𝒂 ∙ 𝟏𝟎𝟎 ]
o Het deel van een monster dat overblijft na drogen, dus alles behalve water → van 0,2 – 0,5 afhankelijk van cel
o Biomassa vers gewicht (totale massa) biomassa gewicht (totale massa * DS * 0,5)
o Wat zit in de droge stof
▪ Organische stof (biomassa, C) → 50% van droge stof
▪ Anorganische stof (zouten, mineralen)
o Dus C-hoeveelheid bepalen = 0,5 x massa na drogen (DS x oorspronkelijke massa)
4 methodes voor de bepaling van biomassa
(1) Obv het aantal progranulen
▪ + oef ▪ Aantal proganules eerst bepalen (3.1) → telkamer
▪ Bereken volume van de cel
o Bacterie: diameter² * lengte
o Fungi: diameter * lengte
▪ Doe dat volume maal zijn dichtheid [kg/dm³] (afgeleid uit soortelijk
gewicht) → hoeveel kg-cel je hebt
▪ Dan droge stof berekenen via droge-stofgehalte * kg-cel
▪ C-hoeveelheid berekenen via 0,5 x droge stof
Opmerkingen
Normale minerale bodems 2250 kg biomassa vers gewicht/ha
Biomassa voor algen 50 – 500 kg vers gewicht/ha
Strooisellaag bosgrond veel hoger !van de fungale filamenten geobserveerd in bodem is slechts 5% levend
(2) Fumigatiemethode van Jenkinson
▪ Een grondmonster wordt gefumigeerd (begast) met CHCl3 (chloroform) om de microbiota af te doden
▪ Ander monster wordt geënt met weinig controle grond, de afgedode microbiota worden substraat voor de geënte microbiota
▪ Respiratie wordt gevolgd voor dat monster + onbegast monster
= CO2 – vrijstelling in C µg /g grond
▪ Dan 10 dagen laten incuberen en meten
▪ Voor beide dan geaccumuleerde CO2 bepaald
o Behandelde grond → hoger (meer voeding) → X
o Onbehandelde grond → Y
▪ F = X – Y [µg C/g grond]
, ▪ Er wordt ook gekeken wat de geënte-microbiota doen met de afgedode microbiota substraat koolstof (100 eenheden C)
o 45 vrijgesteld als CO2 → dus 45% wordt omgezet in CO2 = kc
𝑭
▪ Om dan de initiële totale biomassa-koolstof aanwezig te berekenen doen je biomassa = 𝒌𝒄
[µg C/g grond]
Opmerkingen:
Fumegatie correcter dan eerste methode aangezien daar andere zaken dan cellen ook als C gerekend heeft
Cellen kunnen ipv met chloroform ook met warmtegolf afgedood worden + polymeren zijn meer biodegradeerdbaar (voeding)
(3) ATP-dosering
Levende massa bevat ATP, ongeveer 4mg ATP/g biom-C
We maken de ATP aanwezig in de bodem vrij en kwantificeren het om g biom-C te bepalen + oef
1. Bacteriën/cellen lyseren via
a. NRB (kwaternair detergent) →enkel vrijstelling ATP uit MO
b. TCA (trichloor azijnzuur) = → vrijstelling ATP uit ALLE cellen, ook planten en hogere weefselstructuren
2. ATP laten reageren met luciferase → lichtintensiteit meten
heel snelle methode Jenkinson 10 dagen
Opmerkingen:
▪ Via de bepaalde [ATP] kan je ook de energy charge (EC) bepalen
▪ EC levende biomassa = 0,5 – 1 (typisch 0,8 – 0,95)
▪ EC dode biomassa < 0,5
▪ EC kan voorspellen of het meer katabolisme of anabolisme zal doen
(4) Mathematische simulatie van respiratiecurven
Cellulair metabolisme (ATP nodig) = aangroei + onderhoud (bv vervanging enzymen)
Door Prof. Dr. ir. Nico Boon & Jo De Vrieze
DEEL A: SITUERING VAN MICROBIËLE GEMEENSCHAPPEN
HOOFDSTUK I – MICROBIOTA: FUNCTIONEEL OVERZICHT
1. Situering van de microbiota
1.1. De fylogenetische boom
Op basis van 16S of 18S ribosomaal RNA wordt het leven ingedeeld in 3 domeinen
Archaea
▪ Archaea lijken in vorm/werking sterk op Bacteria maar zijn heel verschillend van de andere 2 obv rRNA
o Membraanlipiden uit ether-bindingen Bacteria uit ester-bindingen
▪ Kunnen leven/overleven extreme en energie-arme omstandigheden
o Door speciale cel-samenstelling + speciale metabole pathways
Bacteria
▪ 2 fylogenetische groepen erg belangrijk
o Proteobacteriën = purper bacteriën
▪ Verder onderverdeeld obv 16S rRNA in 5 groepen (𝛼, 𝛽, 𝛾, 𝜃, 𝜀)
o Gram positieve bacteriën
▪ Celwand is arm aan lipiden
▪ Kunnen sterk zure omstandigheden doorstaan
▪ Gunstige en soms schadelijke eigenschappen
Opmerkingen:
▪ Protozoa en schimmels zijn MO maar nauw verwant aan planten en dieren
▪ Biologisch leven (deloof 1996)
o Compartiment met vermogen te communiceren met interne en externe (omgeving) structuren
o Het compartiment kan groeien door dissepatie van energie, te vermenigvuldigen en steeds te functioneren
→ door fouten die ontstaan/gemaakt worden ontstaan nieuwe betere vormen van levende materie
1.2. Omschrijving micro- en macrobiota
1.3. Outside vs inside microbiota
Microbiële wereld = continuüm waarbij voortdurend wisselwerking is tussen dode en levende materie
▪ Outside microbiota = in de vrije omgeving (bodem, water, lucht) → hierop gefocust in de cursus met referentie naar inside
▪ Inside microbiota = geassocieerd met waardorganismen (planten, dieren)
,1.4. Theoretische concepten over de microbiële ecologie
Twee hoofdtheoriën verklaren de aanwezigheid van soorten
1. Niche-theorie: Darwin
a. Soorten coëxisteren door unieke anapassingen aan specifieke omgevingsfactoren = niche-specialisatie
b. Milieu selecteer de beste soort en bepaalt wie er groeit, deze zal de niche innemen (bepaalde taak uitvoeren)
2. Neutrale theorie: Hubbell
a. Soorten zijn ecologisch gelijkwaardig en diversiteit ontstaan door willekeurige processen (migratie, uitsterven, …)
b. Soortenrijkdom en abundantie in gemeenschappen wordt verklaar door neutrale verschillen tussen soorten
c. Door constante flcx van komende en gaande species zorgt voor voortdurende nieuwe kansen en functies binnen de
gemeenschap van MO
Belangrijke concepten
▪ Multicellulariteit
= MO kunnen een los mengsel zijn, elk onafhankelijk van elkaar maar kunnen zich ook organiseren tot een soort multigenoom
systeem (verschillende MO samen) → samenwerking:
o Transfer van genen tussen organismen
o Cross-feeding tussen cellen
o Opbouw van 3D structuren o.a. kanalen
o Cellulaire differentiatie → sommige oudere cellen vermeerderen niet meer maar onderhouden de jongeren wel)
▪ Redundantie
= een grote diversiteit aan species is nodig om een taak te volbrengen (vb. 70tal #MO voor afbraak beukenblad
= aantal sleutel-species en veel figuranten voor de taak
o Relatie soortenrijkdom en functionaliteit ecosysteem → complementariteitsmechanisme
▪ Soorten dragen evenveel bij aan functionaliteit en zijn complementair (andere taken)
▪ Sommigen of meerdere doen dezelfde functie en zijn functioneel overbodig
→ zorgt wel voor een buffer in het ecosysteem
▪ Co-evolutie
o MO zijn voortduren in co-evolutie met elkaar = ze evolueren samen
o MO co-evolueren ook voortdurende met hogere organismen, ze adapteren aan hogere planten/dieren en visa versa
o Black-queen hypothesis
▪ Theorie die verklaart waarom MO vaak afhankelijk zijn van elkaar voor essentiële functies
▪ Black queen: kostbare maar, lekkende functies wordt slechts door een paar organismen gedaan
→ afbreken toxine bv
▪ Cheaters: zij stoppen met het uitvoeren van deze functie omdat ze profiteren van de bijdrage van andere
▪ Dit leidt tot een taakverdeling binnen de gemeenschap, waarbij de productieve individuen vastzitten in hun
rol, wat co-evolutie en zelfs de evolutie van nieuwe functies mogelijk maakt
▪ Krijgt dus specialisatie binnen een soort → risico! Want al 1 schakel wegvalt → berusten op elkaar
▪ Microbiële hubs
o MO werken in serie: complex substraat → eenvoudige metabolieten met hierin vitale knooppunten = hubs
o Indien een van de schakels getroffen wordt → sterke terugval van functionaliteit
▪ MRM: Microbial Resource Managment
o Microbiële gemeenschap wordt beschouwd als een bedrijf dat gemanaged en gestuurd kan worden en zo de
capaciteiten van de microbiële mengculturen in de gemeenschap goed te organiseren
o Moet hiervoor wel inzicht verkrijgen in het multigenoom van de microbiële gemeenschap
▪ Welke species (genen?), wie doet wat, hoe interageren ze en zorgen ze voor expressie van genen van anderen,
hoe sterk veranderd de dynamiek? (traag = evolutie, rap = chaos, verstoring), is er een zekere graad van
leiderschap
, o MRM wordt doorgevoerd obv 3 pa rameters
▪ Rr Range weighed richness index = verscheidenheid aan genen/species in de gemeenschap
→ berekend uit aantal streepjes aanwezig in DGGE barcode
▪ Dy Dynamiek van species → verschuiving van 20% van species per week = normale dynamiek
→ berekend via bewegend venster analyse, samenstelling gemeenschap steeds getoetst
▪ Co Community organisation = geeft organisatie gemeenschap weer (gelijkheid)
→ species gelijk in waarde/betekenis in gemeenschap?
o Ja? → complete eveness
▪ Gemeenschap kan snel aanpassen aan nieuwe omstandigheden
▪ Wel niet georganiseerd (al lemaal gelijk) → gevoelig voor infectie
o Pareto-toestand
▪ Normaal evolueert gemeenschap hiernaartoe
▪ 20% van species vervullen 80% van de taken
▪ Functionele toestand maar totale ineenstorting bij felle stress
2. Algemeen overzicht van microbiota werkzaam in de bodem
Hieronder volgt een overzicht van de belangrijskte 6 groepen MO werkzaam in de bodem + hun kenmerken
2.1. Bacteriën / Archaea (domein 1-2)
Metabolisch de meest diverse groep (zowel anaeroob als aeroob, autotroof als heterotroof) dat cruciaal zijn voor de C, N, S, P-cycli
Groei De meesten zijn organotroof = leven van organische verbindingen (heterotroof)
Sommigen zijn chemolithotroof = energiebron is een redoxreactie (autotroof)
Vermenigvuldiging gebeurt meestal door dwarse deling (klonen), seksuele interacties meestal in geval van stress
1. Soorten energiebronnen
▪ Nitrificatie + oef
o Belang waterzuivering
o Autotrofen
o AOB = ammoniak-oxiderende bacteriën
o AOA = ammoniak-oxiderende archaea
o NOB = nitriet-oxiderende bacteriën
o Eenstaps nitrificatie → geen AOB/AOA
▪ Zwavel oxidatie + oef
o Vorming zwavelzuur
o Praktisch probleem zwavelzuur in riool → sewer corrosion = betonrot
▪ IJzer oxidatie: biologisch roesten ijzer
▪ HOB: hot topic voor microbieel eiwit
▪ H2 + CO2
o Hydrogenatiereactie
o Uitgevoerd door hydrogenotrofe methanogenen (archaea!)
K-strateeg → autochtoon
Groeien zeer traag en lange generatietijd
Fysiologisch optimaal aangepast aan hun specifieke niche
Grote affiniteit voor voedsel (Ks = laag) dus kunnen bij lage concentraties
ook voedsel opnemen
r-strateeg → zymogeen
Opportunisten die explosief groeien zodra er veel makkelijk voedsel beschikbaar is
, 2. Onderverdeling naar type waterstof-acceptor (elektron) dat ze kunnen benuttigen
Redoxpotpotentiaal (Eh) > 0 → aëroob of oxisch milieu
Redoxpotentiaal (Eh) < 0 → anaëroob of anoxische molieu
▪ Respiratie = O2 of anorganische component als electronen-acceptor
▪ Fermentatie = organische molecule als electorenacceptor
3. Nutriëntenvereiste bodembacteriën
85% van de bodembacteriën heeft 1 of meer groeifactoren (AZ, vitaminen, bodemextract) nodig voordat ze groeien
Ecologie ▪ 105-108/g grond
▪ Voorkeur vochtige grond en met hoog gehalte organisch materiaal
▪ Ingedeeld in
o Autochtone bodembacteriën = stabiele populatie, afstamming populaties die al lang op die specifieke
plaats voorkomen, humusafbrekers (Arthrobacter), K-strateeg
o Zymogene bodembacteriën = snelle groeiers bij hoge organische influx (Bacillus), r-strateeg
Betekenis ▪ Ze zijn cruciaal zijn voor de C, N, S, P-cycli
▪ Autochtone zorgen voor humusmineralisatie → nutriënten voor planten
▪ Exclusieve rol fixatie N2 en denitrificatie NO3-
▪ Vrijwel alleenheersers in anaërobe gronden
▪ Sommige pathogenen = tellurische pathogenen = ziekteverwekkers die leven in de bodem
o Plant: zachtrot, kankers (Agrobacterium)
o Mens en dier: anthrax, tetanos
Telling 2 methodes
1. Rechtstreek: microscopie en telkamer
2. Onrechtstreeks
a. Uitplating op vaste agarbodem + CFU bepalen
b. Proefbuis
c. Moleculaire technieken → verder
Belangrijke opmerking
Voor de groei van autochtone bacteriën is nutriëntarm medium vereist, nutriëntrijk voor opkweek zymogene species
2.2. Actinomyceten
Actinomyceten = draadvormige bacteriën (gram-positief) ( niet laten misleiden door ‘myceten’, het zijn geen fungi) (domein: Bacteria)
▪ Produceren antibiotica en geosmine (grondgeur)
▪ Tolerant voor droogte
▪ Gespecialiseerd in de afbraak van complexe, resistente organische verbindingen (bio-remidiatie)
Groei Organotroof (an)aeroob
Ecologie ▪ 105-108 grond
▪ 10-50% van biomassa vruchtbare grond
▪ Bevoordeeld in droge grond → zijn droogtetolerant → hun conidiën weerstaan vlot de droogte
▪ Benadeeld in zure grond → fysiologisch zwak onder pH 5
, Betekenis Ze spelen een zeer belangrijke rol en ze komen in grote aantallen voor, daarom apart van bacteriën besproken
1. Ontbinding van resistente componenten (trage groeiers, wel enzymatisch potentieel) → bv chitine afbraak
2. Boven 40°C komen enkel nog actinomyceten en sporenvormende bacteriën voor (composthoop)
3. Produceren geosmine
4. Zorgen voor humusvorming: mycelium van actinomyceten beat tal van aromatische componenten (zie verder)
5. Bodemhomeostasis: produceren belangrijke antibiotica (hieronder kenmerken antibiotica algemeen)
a. Beïnvloeden groei van MO negatief (geproduceerd ook door MO)
b. Werken in op verschillende chemische-structuren (lactonring, nitro-verbinding, polypeptide, …)
c. Variërend spectra
i. Tegen G-: streptomycine → inhibitie van eiwitsynthese
ii. Tegen G+: penicilline → inhibitie van celwandsynthese
iii. Tegen beide: tetracycline
iv. Tegen fungi: actidione, antamycine
v. Bacitracine, chlooramfenicol → inhibitie van celmebraanwerking
6. Ziekteverwerkers
a. Plantenziektes zoals aardappelschurft
b. Mens en dier
i. Nocardia asteroïdes → nocardiosis: groei van mycelium in longen/nieren als gevolg van
verminderd weerstandsvermogen, contaminatie via grond en stof
7. Belang in N-fixatie: sommigen vormen nodulen op niet-leguminosen
Telling ▪ Rechtstreeks: microscopie van telkamer
▪ Onrechtstreeks: agarplaat
o Selectieve: toevoeging speciaal substraat (chitine) of remstoffen (actidione → tegen fungi)
o Niet-selectief: differentiatie obv kolonie uitzicht en geur
2.3. Fungi
▪ Vormen myceliumnetwerken
▪ Breken lignine en cellulose af
▪ Zorgen voor de bodemstructuur
▪ Domineren in zure en droge omstandigheden
Groei Organotroof aeroob
Ecologie ▪ In A-horizon (0-30cm diep)
▪ 10 – 100m! mycelium/g grond
▪ Bevoordeeld door
o Hoge concentratie organisch material
o Hoge O2-concentratie
o Hoog vochtgehalte
o Lage pH → pH 2-5 geeft hen monopolie
▪ Dominantie van bepaald species van fungi is ster afhankelijk van het plantenbestand
▪ Temperatuur
o Max tot 40°C
o Warme regio → Aspergillus en Trichoderma zijn dominant
o Koude regio → Mucor en Penicillium zijn dominant
▪ Overleven meerdere jaren in bodem dmv sclerotia (bundel van mycelium)
Betekenis 1. Afbraak organisch materiaal → zeer sterke enzymatische activiteit (cellulose, lignine, hemicellulose, …)
2. Hogere fungi: asco- en basidiomyceten → voeden zich met wortelexudasen van grassen/houtachtige gewassen
a. Belang in voeding (paddenstoel), geneesmiddelen, toxicologie
, b. Bodemevaluatie: stinkzwam → humusrijk vliegenzwam → zure grond
c. MER = Milieu effect rapportering → bij Pb-pollutie (lood) verdwijnt Hanekam
3. Bijdrage bodemstabiliteit
4. Bijdrage humusvorming via synthese melanine en chitine → blijven na sterfte achter in bodem als humus
5. Directe interactie met planten
a. Negatief: plantenpathogene schimmels
b. Positief: mycorrhizen (zie verder)
6. Predeteren op nematoden door afscheiden enzymen die de nematoden ‘oplossen’
7. Infectie en intoxicatie (negatief)
a. Groeit op gewas → veevoeder → Aspergillus flavus → aflatoxine (schade dier/mens)
b. Schimmel op groeiend gras → Pithomyces chartarum → sterfte schapen in Nieuw-Zeeland
Telling ▪ Rechtstreeks: kleuren en opmeten van mycelium onder microscoop
▪ Onrechtstreeks: uitplating op selectieve agarbodems (hoge [nutriënt], lage pH, bacteriële remstof (streptomyc bv)
Bepaling v Hoeveelheid fungale biomassa kan selectief bepaald worden door extractie van ergosterol, een typische fungale
biomassa component → bepaling via HPLC (High Performance Liquid Chromatography)
2.4. Protozoa
▪ Grazen op bacteriën (‘regulators’)
▪ Houden bacteriële populatie jong en actief
▪ Versnellen nutriëntenkringlopen
Groei 3 types te onderscheiden (aeroob/anaeroob/facultatief komen voor)
▪ Foto- en lithotroof → licht + mineralen
▪ Organotroof en saprofaag → opname organisch materiaal in oplossing
▪ Organotroof en fagotroof → opname organisch materiaal in particuliere vorm
(biofaag als er levende bacteriën opgenomen worden)
Ecologie ▪ Bovenste cm van bodem
▪ 104-105/g grond
▪ Voorkeur vochtige gronden met veel organisch materiaal
▪ Bij ongunstige condities → snel cyste vorming = overlevingstechniek
Betekenis 1. Ziekteverwekkers
a. Amoeba: dysenterie, hersenvliesontsteking
b. Flagellata: slaapziekte
c. Sporozoa: malaria
2. Potentieel belangrijk voor verspreiden bacteriën zoals nitrificeerders in bodem
a. Door bv verspreiden van nitrificeerders (minder mobiel in bodem), protozoa = transportmiddel
b. Case: Legionella pneumophila → protozoa bevorderen deze op 3 manieren (1) necrotrofie aangezien
Lp op dode protozoa kan voeden of het als gastheer kan gebruiken (2) verspreiding, als Lp
opgenomen wordt, wordt hij niet verteerd en rijst het mee, (3) activatie van Lp in de protozoa →
wordt virulenter
3. Regulatie bacteriële densiteit via grazen
a. 103! Bacteriën nodig voor opbouw 1 protozoale cel (105/g grond < bacteriële densiteit nodig)
b. Ze grazen selectief → voorkeursprooien, andere worden veel minder of totaal niet benuttigd
4. Versnellen kringlopen van nutriënten (zie verder)
5. Actief houden van de bacteriën
a. In aquatische milieu’s predateren protozoa zeer actief op bacteriën → 17% van metabolisch actieve
bacteriën begraasd per dag (60% van die biomassa ingebouwd in protozoa)
→ houdt bacteriële gemeenschap jong, actief en competitief
b. Gemeten via pulse-chase labelling + oef → concept goed doorhebben
, i. Pulse (Merken): Aan een waterstaal worden radioactief gemerkte stoffen (3H-thymidine en
14
leucine) toegevoegd. De bacteriën nemen deze op in hun DNA en eiwitten
ii. Chase (Verdunnen): Na een korte tijd voegt men een enorme overdosis (500x) niet-
radioactieve stoffen toe. Hierdoor stopt de opname van radioactiviteit, maar de bacteriën
blijven normaal doorgroeien. De bacteriën zijn nu "gelabeld"
iii. Incubatie en Meting: Het staal wordt geïncubeerd zodat protozoa de gemerkte bacteriën
kunnen opeten. Via filtratie scheidt men de protozoa van de bacteriën en meet men de
radioactiviteit in de protozoa → zegt hoeveel is opgegeten en hoeveel biomassa erin zit
Telling ▪ Rechtstreeks: microscopie (cystes goed te zien onder microscoop → zie vroeger Paramecium)
▪ Onrechtstreeks: agarplaat ingezaaid met prooi-bacteriën → observatie van klaringszones
2.5. Algen
▪ Fotolithotroof
▪ Pioniers op kale gronden
▪ Sommigen (cyanobacteriën) fixeren stikstof
Groei Fototroof en lithotroof → licht + mineralen
Ecologie ▪ In bovenste cm: 500-5000 cellen/g grond, soms 1m diep
▪ Bevoordeling bij vochtige en braakliggende gronden
o Blauwgroene algen en kiezelwieren → neutrale tot licht alkalische gronden
o Groene algen → zure gronden
Betekenis ▪ Rijst paddies
o N-fixatie door blauwgroen algen
o Aëreatie van de waterlaag → zelfreinigend vermogen vijvers → oef
▪ Braakliggende gronden
o Beperken erosie
o Pioniers initiatie van kolonisatie → algen en korstmossen op vulkanische en platgebrande gronden
▪ Rotsen → langzame erosie door organische zuren
Telling ▪ Rechtstreeks: telling onder microscoop of extractie chlorofyl uit bodem met solvent
▪ Onrechtstreeks: meest waarschijnlijke aantallen (MWA) in mineraal vloeibaar medium
2.6. Virussen
▪ Parasiteren op alle levensvormen
▪ Zorgen via het ‘kill the winner’-principe voor diversiteit en mediëren gentransfer
Groei en morfologie Ze benuttigen de reserves als enzymatische mechanismen van de waardcel
Vermenigvuldiging komt enkel voor in jonge cellen
Verschillende levensfasen (virulent/getemperd), verschillende vormen en (DNA/RNA met of zonder mantel)
Ecologie Ze komen massaal voor in het milieu → bv 108/ml zeewater
1. Kunnen zowat alle levensvormen infecteren
2. Verspreiding in bodem via micro- en macroorganismen (nematoden belangrijk – 50% meercel dieren)
3. Overleving in bodem sterk afhankelijk van milieufactoren
a. Watergehalte, pH, humusgehalte
b. Voor alle 3 geldt: hoe lager, hoe sneller inactivatie
Betekenis ▪ Hun rol in natuur is nog niet duidelijk, ze zorgen wel voor kill-the-winner (KtW) → ze houden meest
succesvolle MO onder controle want groeien best, krijgt voortdurend verschuiving in top-species en zo
komen redundante species ook aan bod
, ▪ Verwekken ziektes bij mens, plant, dier
▪ Ondermijnen van geënte bacteriën zoals Rhizobium (zie verder), plantengroei bevorderende bacteriën
(PGPB)
▪ Transductie van genetisch materiaal (R-factoren)
▪ Eventueel alternatief voor antibiotica, selectiviteit: ontsmettingsproduct
3. Microbiële densiteit
3.1. Telling van het aantal propagulen → cellen/mL
Propagule = elk deel of structuur van een organisme (zaad, spoor, cel, …) dat kan dienen voor voortplanting en verspreiding naar een
nieuwe locatie zodat het kan uitgroeien tot een nieuw individu of een nieuwe kolonie = voortplanting/verspreidingsseenheid
Directe telling (tijdrovend)
▪ Elektronenmicroscoop of lichtmicroscoop of fluorescentiemicroscoop
▪ Telraam
▪ Gebruik van functionele kleurstoffen → kan levende cellen herkennen
o Bv DNA kleurstoffen → binden DNA → alles dat oplicht is bacterie/virus
o Bv kleurstof dat fluoresceert na enzymatische afbraak → voornamelijk opsporen levend schimmelmycelium
▪ Bv FDA = fluoresceïne diacetaat
Indirecte telling (fouten, dispersie, openbreken)
▪ Vergt cultivatiestap (uitplaten, al dan niet selectief) op vaste voedingsbodem of in vloeibaar medium
o Vaste voedingsbodem → aard van medium ook grote impact op resolutie (tabel)
▪ Grond-agar
▪ Voedingsagar
o Vloeibaar voedingsmedium
▪ Aanleggen van een MWA (meest waarschijnlijke aantallen)
• Je maakt een seriële verdunning (10-1, 10-2, … bv)
• Je inoculeert per verdunning 3 of 5 buisjes, elk buisje bevat geschikt groeimedium
• Je incubeert onder juiste omstandigheden
o Groei = positief (troebelheid, gas, kleurreactie)
o Geen groei = negatief
• MWA bepalen via tabel
o In voorbeeld heb je 5 – 2 – 0 resultaat
o Betekent dat tweede verdunning rond detectiegrens van MWA zit
o Via tabel dan 5-2-0 code omzetten naar WMA = geschat aantal
• Dan concentratie berekenen
o MWA * inverse van tweede verdunning = MWA*102 cellen/mL
▪ MWA typisch gebruikt voor waterkwaliteit na te gaan
▪ Ook handige techniek om algen of nitrificerende bacteriën aantal te bepalen → groeien niet graag op agar
Het aanleggen van een MWA-bepaling houdt in dat men seriële verdunningen van een staal inoculeert in
meerdere buisjes, de aanwezigheid van groei registreert en via statistische tabellen het meest waarschijnlijke
aantal micro-organismen bepaalt.
Elektronenmicroscoop detecteert 109 N/g (N = partikels) andere microscopen
factor 100 lager uitplating vast voedingsmedium nog eens factor 100-1000
lager
→ die hebben dus een veel lagere resolutie dan de elektronenmicroscoop en zullen bv alle virussen gemist hebben
, 90% is dus dood, 10% levend wat van groot belang vormt voor de gebruikte
analysetechniek voor het #progranules te bepalen
→ afvragen moeten we levende/dode of alles hebben
→ bv fluorescentie onderscheiding maken
3.2. Bepaling van de biomassa → cel droge of C gewicht/L
De levende biomassa (ca 500 mg C/kg grond) is een tactische reserve voor nutriënten (N, P) en katalysator voor omzettingen
Belangrijk om te weten
Belangrijke concepten
𝝆 ha = 10 000 m²
▪ Soortelijk gewicht [ 𝝆 𝒔𝒕𝒐𝒇 ]
𝒘𝒂𝒕𝒆𝒓 1,25 x 1012 bact = 1g biomassa DS
o Dimensieloze eenheid 1 m mycelium draad = 1µg biomassa DS
o Geeft aan hoe zwaar een stof is in vergelijking met water 1 km mycelium draad = 1 g biomassa DS
o Water bij 4°C → 𝜌 = 1, dus als soortelijk gewicht van een stof > 1 zal het zinken
o Aangezien 𝜌𝑤𝑎𝑡𝑒𝑟 = 1 → soorteloijk gewicht = dichtheid met kg/dm³ erbij gezet
𝒎𝒂𝒔𝒔𝒂 𝒏𝒂 𝒅𝒓𝒐𝒈𝒆𝒏
▪ Droge stof-gehalte (%) [ 𝒐𝒐𝒓𝒔𝒑𝒓𝒐𝒏𝒌𝒆𝒍𝒊𝒋𝒌𝒆 𝒎𝒂𝒔𝒔𝒂 ∙ 𝟏𝟎𝟎 ]
o Het deel van een monster dat overblijft na drogen, dus alles behalve water → van 0,2 – 0,5 afhankelijk van cel
o Biomassa vers gewicht (totale massa) biomassa gewicht (totale massa * DS * 0,5)
o Wat zit in de droge stof
▪ Organische stof (biomassa, C) → 50% van droge stof
▪ Anorganische stof (zouten, mineralen)
o Dus C-hoeveelheid bepalen = 0,5 x massa na drogen (DS x oorspronkelijke massa)
4 methodes voor de bepaling van biomassa
(1) Obv het aantal progranulen
▪ + oef ▪ Aantal proganules eerst bepalen (3.1) → telkamer
▪ Bereken volume van de cel
o Bacterie: diameter² * lengte
o Fungi: diameter * lengte
▪ Doe dat volume maal zijn dichtheid [kg/dm³] (afgeleid uit soortelijk
gewicht) → hoeveel kg-cel je hebt
▪ Dan droge stof berekenen via droge-stofgehalte * kg-cel
▪ C-hoeveelheid berekenen via 0,5 x droge stof
Opmerkingen
Normale minerale bodems 2250 kg biomassa vers gewicht/ha
Biomassa voor algen 50 – 500 kg vers gewicht/ha
Strooisellaag bosgrond veel hoger !van de fungale filamenten geobserveerd in bodem is slechts 5% levend
(2) Fumigatiemethode van Jenkinson
▪ Een grondmonster wordt gefumigeerd (begast) met CHCl3 (chloroform) om de microbiota af te doden
▪ Ander monster wordt geënt met weinig controle grond, de afgedode microbiota worden substraat voor de geënte microbiota
▪ Respiratie wordt gevolgd voor dat monster + onbegast monster
= CO2 – vrijstelling in C µg /g grond
▪ Dan 10 dagen laten incuberen en meten
▪ Voor beide dan geaccumuleerde CO2 bepaald
o Behandelde grond → hoger (meer voeding) → X
o Onbehandelde grond → Y
▪ F = X – Y [µg C/g grond]
, ▪ Er wordt ook gekeken wat de geënte-microbiota doen met de afgedode microbiota substraat koolstof (100 eenheden C)
o 45 vrijgesteld als CO2 → dus 45% wordt omgezet in CO2 = kc
𝑭
▪ Om dan de initiële totale biomassa-koolstof aanwezig te berekenen doen je biomassa = 𝒌𝒄
[µg C/g grond]
Opmerkingen:
Fumegatie correcter dan eerste methode aangezien daar andere zaken dan cellen ook als C gerekend heeft
Cellen kunnen ipv met chloroform ook met warmtegolf afgedood worden + polymeren zijn meer biodegradeerdbaar (voeding)
(3) ATP-dosering
Levende massa bevat ATP, ongeveer 4mg ATP/g biom-C
We maken de ATP aanwezig in de bodem vrij en kwantificeren het om g biom-C te bepalen + oef
1. Bacteriën/cellen lyseren via
a. NRB (kwaternair detergent) →enkel vrijstelling ATP uit MO
b. TCA (trichloor azijnzuur) = → vrijstelling ATP uit ALLE cellen, ook planten en hogere weefselstructuren
2. ATP laten reageren met luciferase → lichtintensiteit meten
heel snelle methode Jenkinson 10 dagen
Opmerkingen:
▪ Via de bepaalde [ATP] kan je ook de energy charge (EC) bepalen
▪ EC levende biomassa = 0,5 – 1 (typisch 0,8 – 0,95)
▪ EC dode biomassa < 0,5
▪ EC kan voorspellen of het meer katabolisme of anabolisme zal doen
(4) Mathematische simulatie van respiratiecurven
Cellulair metabolisme (ATP nodig) = aangroei + onderhoud (bv vervanging enzymen)
