Samenvatting GKA – deeltentamen 1 (gentherapie + kanker)
Er zijn drie soorten regulerende DNA sequenties:
Promotor bindt aan RNA polymerase. In de promotor sequentie is ook een bepaalde
TATA sequentie aanwezig waaraan TBP bindt (TATA-box binding protein). TBP is een
onderdeel van de transcriptiefactor TFIID die betrokken is bij het uit elkaar halen van het
dubbelstrengse DNA. Dit wordt gedaan door het DNA te buigen.
Enhancer bindt aan activator eiwitten. Een voorbeeld is Sp1, dat een DNA,
dimerisatie en cofactor binding domein heeft.
Silencer bindt aan repressor eiwitten
Rood = activator
Geel = mediator/co-activator.
Blauw = basale
transcripitiefactoren (binden aan de
promotor en vormen samen met RNA
polymerase het basale
transcriptiecomplex). TBP is dus een
basale factor.
In bovenstaand plaatje staan wel 4 fouten:
1. Basale activator moet basale factor zijn
2. Het DNA begint gelijk met een coding region, maar in werkelijkheid begint het altijd met
een untranslated region (UTR)
3. TBP is niet hetzelfde als TFIID (TBP is een van de drie delen van TFIID)
4. Repressord hoeven niet perse te interfereren om inhibitoir te zijn
De modernere versie van
het eerste plaatje. Er is in
beide plaatjes wel te zien
dat het DNA een loop
maakt.
HAT: histon acetyl transferase
HDAC: histon deacetylase
MTase: methyl transferase
DNMT: DNA methyl transferase
NFkB: nuclear factor-kB
NFAT: nuclear factor of activated T-cells
PTEF: positive transcription elongation factor
, Na de transcriptie is er hnRNA, pre-mRNA,
ontstaan. Tijdens de transcriptie al wordt dit
pre-mRNA omgezet in mRNA door RNA
processing. Dit omvat drie stappen:
Capping
Splicing
Poly-adenylering
Na de transcriptie is er natuurlijk
translatie. Hierbij scant het kleine deel
eerst lang het mRNA totdat het langs het
startcodon (AUG) komt. Dan bindt ook
het grote subunit en begint de translatie.
Genetische therapieën
1. Triplex-strategie: blokkeert
transcriptie. Bindt aan dsDNA en
maakt er een drie strenge spiraal van.
2. Anti-sense therapie: blokkeert
translatie. Bindt aan mRNA (in kern
en cytosol) waardoor geen translatie
kan plaatsvinden.
Voor beide soorten therapieën worden DNA-oligonucleotiden
(oligo’s ) van 16-20 basenparen gebruikt. Ze moeten 16-20
basen paren lang zijn om specifiek te kunnen zijn.
Daarnaast moet er gekeken worden welke soort ‘sense’ het
oligo moet zijn. mRNA is + sense, dus dan moet de oligo –
sense (antisense) zijn.
De oligo’s kunnen ook bepaalde modificaties hebben die
zorgen voor een betere opname. Hierbij kan een fosfaatgroep
vervangen worden door een S (S-oligo), door een thiol (SH,
thiol-oligo) of door een methyl groep. Dit alles om te zorgen
dat de negatieve lading minder wordt, wat zorgt voor een
betere opname.
,Een ander molecuul dat ook gebruikt kan worden is een morfolino. Morfolino’s worden
alleen gebruikt bij de antisense therapie. Het verschil met DNA is dat het een 6 ring bevat, een
ongebruikelijke stikstof en een P-O is nu een P-N verbinding. Hoe verder een morfolino na
het startcodon AUG wordt geplaats, hoe minder effectief het is. Na het startcodon vindt er pas
eiwitsynthese plaats, daarvoor heb je alleen scanning van het kleine ribosomale deel.
Blijkbaar zijn morfolino’s dus beter in het blokkeren van het scannen dan van de
eiwitsynthese.
Bij de triplex strategie heb je een driedubbele helix. Bij het vormen
van deze triplex worden unieke H-bruggen gemaakt. Het nadeel is
dat dit alleen werkt als er in de sequentie een reeks A’tjes zit (en de
oligo dus bestaat uit T’tjes of U’tjes). Dit wordt ook wel het
sequentie probleem genoemd.
Bij zowel de triplex als de antisense strategie zijn er verschillende manieren om de expressie
te blokkeren.
Triplex: zorgen dat er geen binding kan plaatsvinden omdat er geen compleet RNA
gemaakt kan worden
Antisense: zorgen dat geen compleet eiwit gemaakt kan worden of dat het RNA al wordt
geknipt door ribonuclease H voordat de translatie überhaupt plaats kan vinden. Deze
laatste manier komt wel overheen met hoe RNAi werkt.
, Potentiële toetsvraag: Wat is het therapeutische molecuul bij anti-sens theraptie? Geef
details omtrent dit molecuul.
Een 16-20 basenpaar lange oligo. Deze oligo moet antisense zijn omdat het mRNA sense
is. Deze oligo kan bepaalde modificaties bevatten (zoals S- en thio-oligo) waardoor de
opname verbetert wordt.
Als de vraag was gegaan over triplex had het sequentie probleem aangehaald kunnen
worden.
3. Gentherapie: een door mensen geïnduceerde verandering in het genotype. Hierbij is er een
genetische correctie van een mutant, ziekte-veroorzakend genotype.
Het eerste patiëntjes die gentherapie onderging
was Ashanti en zij leed aan ADA-SCID:
adenosine deaminase-severe combined
immunodeficiency. Bij deze ziekte mist de patiënt
het ADA gen wat betrokken is bij het purine
metabolisme. De primaire functie van het ADA
gen is bij de ontwikkeling en het behouden van het
immuun systeem. Bij ADA-SCID heeft de patiënt
geen NK-, T- of B-cellen.
Ashanti haar T-cellen werden behandeld met een retrovirus met daarin het ADA gen. Er werd
gebruik gemaakt van PEG-ADA. Hierbij is ADA gekoppeld aan polyethylene glycerol
waardoor het minder snel wordt opgenomen en dus ook minder snel wordt afgebroken. Maar
hoe kan het dat deze therapie bij Ashanti werkte want T-cellen leven niet zo lang? Dit is te
verklaren doordat er ook stamcellen moeten zijn afgenomen waardoor deze naar het beenmerg
zijn gegaan.
Voor gentherapie worden humane cellen
afgenomen bij een patiënt en deze worden ex vivo
behandeld met een vector (virus). Vervolgens
worden deze cellen terug gegeven aan de patiënt.
Er zijn drie soorten regulerende DNA sequenties:
Promotor bindt aan RNA polymerase. In de promotor sequentie is ook een bepaalde
TATA sequentie aanwezig waaraan TBP bindt (TATA-box binding protein). TBP is een
onderdeel van de transcriptiefactor TFIID die betrokken is bij het uit elkaar halen van het
dubbelstrengse DNA. Dit wordt gedaan door het DNA te buigen.
Enhancer bindt aan activator eiwitten. Een voorbeeld is Sp1, dat een DNA,
dimerisatie en cofactor binding domein heeft.
Silencer bindt aan repressor eiwitten
Rood = activator
Geel = mediator/co-activator.
Blauw = basale
transcripitiefactoren (binden aan de
promotor en vormen samen met RNA
polymerase het basale
transcriptiecomplex). TBP is dus een
basale factor.
In bovenstaand plaatje staan wel 4 fouten:
1. Basale activator moet basale factor zijn
2. Het DNA begint gelijk met een coding region, maar in werkelijkheid begint het altijd met
een untranslated region (UTR)
3. TBP is niet hetzelfde als TFIID (TBP is een van de drie delen van TFIID)
4. Repressord hoeven niet perse te interfereren om inhibitoir te zijn
De modernere versie van
het eerste plaatje. Er is in
beide plaatjes wel te zien
dat het DNA een loop
maakt.
HAT: histon acetyl transferase
HDAC: histon deacetylase
MTase: methyl transferase
DNMT: DNA methyl transferase
NFkB: nuclear factor-kB
NFAT: nuclear factor of activated T-cells
PTEF: positive transcription elongation factor
, Na de transcriptie is er hnRNA, pre-mRNA,
ontstaan. Tijdens de transcriptie al wordt dit
pre-mRNA omgezet in mRNA door RNA
processing. Dit omvat drie stappen:
Capping
Splicing
Poly-adenylering
Na de transcriptie is er natuurlijk
translatie. Hierbij scant het kleine deel
eerst lang het mRNA totdat het langs het
startcodon (AUG) komt. Dan bindt ook
het grote subunit en begint de translatie.
Genetische therapieën
1. Triplex-strategie: blokkeert
transcriptie. Bindt aan dsDNA en
maakt er een drie strenge spiraal van.
2. Anti-sense therapie: blokkeert
translatie. Bindt aan mRNA (in kern
en cytosol) waardoor geen translatie
kan plaatsvinden.
Voor beide soorten therapieën worden DNA-oligonucleotiden
(oligo’s ) van 16-20 basenparen gebruikt. Ze moeten 16-20
basen paren lang zijn om specifiek te kunnen zijn.
Daarnaast moet er gekeken worden welke soort ‘sense’ het
oligo moet zijn. mRNA is + sense, dus dan moet de oligo –
sense (antisense) zijn.
De oligo’s kunnen ook bepaalde modificaties hebben die
zorgen voor een betere opname. Hierbij kan een fosfaatgroep
vervangen worden door een S (S-oligo), door een thiol (SH,
thiol-oligo) of door een methyl groep. Dit alles om te zorgen
dat de negatieve lading minder wordt, wat zorgt voor een
betere opname.
,Een ander molecuul dat ook gebruikt kan worden is een morfolino. Morfolino’s worden
alleen gebruikt bij de antisense therapie. Het verschil met DNA is dat het een 6 ring bevat, een
ongebruikelijke stikstof en een P-O is nu een P-N verbinding. Hoe verder een morfolino na
het startcodon AUG wordt geplaats, hoe minder effectief het is. Na het startcodon vindt er pas
eiwitsynthese plaats, daarvoor heb je alleen scanning van het kleine ribosomale deel.
Blijkbaar zijn morfolino’s dus beter in het blokkeren van het scannen dan van de
eiwitsynthese.
Bij de triplex strategie heb je een driedubbele helix. Bij het vormen
van deze triplex worden unieke H-bruggen gemaakt. Het nadeel is
dat dit alleen werkt als er in de sequentie een reeks A’tjes zit (en de
oligo dus bestaat uit T’tjes of U’tjes). Dit wordt ook wel het
sequentie probleem genoemd.
Bij zowel de triplex als de antisense strategie zijn er verschillende manieren om de expressie
te blokkeren.
Triplex: zorgen dat er geen binding kan plaatsvinden omdat er geen compleet RNA
gemaakt kan worden
Antisense: zorgen dat geen compleet eiwit gemaakt kan worden of dat het RNA al wordt
geknipt door ribonuclease H voordat de translatie überhaupt plaats kan vinden. Deze
laatste manier komt wel overheen met hoe RNAi werkt.
, Potentiële toetsvraag: Wat is het therapeutische molecuul bij anti-sens theraptie? Geef
details omtrent dit molecuul.
Een 16-20 basenpaar lange oligo. Deze oligo moet antisense zijn omdat het mRNA sense
is. Deze oligo kan bepaalde modificaties bevatten (zoals S- en thio-oligo) waardoor de
opname verbetert wordt.
Als de vraag was gegaan over triplex had het sequentie probleem aangehaald kunnen
worden.
3. Gentherapie: een door mensen geïnduceerde verandering in het genotype. Hierbij is er een
genetische correctie van een mutant, ziekte-veroorzakend genotype.
Het eerste patiëntjes die gentherapie onderging
was Ashanti en zij leed aan ADA-SCID:
adenosine deaminase-severe combined
immunodeficiency. Bij deze ziekte mist de patiënt
het ADA gen wat betrokken is bij het purine
metabolisme. De primaire functie van het ADA
gen is bij de ontwikkeling en het behouden van het
immuun systeem. Bij ADA-SCID heeft de patiënt
geen NK-, T- of B-cellen.
Ashanti haar T-cellen werden behandeld met een retrovirus met daarin het ADA gen. Er werd
gebruik gemaakt van PEG-ADA. Hierbij is ADA gekoppeld aan polyethylene glycerol
waardoor het minder snel wordt opgenomen en dus ook minder snel wordt afgebroken. Maar
hoe kan het dat deze therapie bij Ashanti werkte want T-cellen leven niet zo lang? Dit is te
verklaren doordat er ook stamcellen moeten zijn afgenomen waardoor deze naar het beenmerg
zijn gegaan.
Voor gentherapie worden humane cellen
afgenomen bij een patiënt en deze worden ex vivo
behandeld met een vector (virus). Vervolgens
worden deze cellen terug gegeven aan de patiënt.
