Methoden en technieken
1. Vergelijk conventionele lichtmicroscopie met de transmissie elektronenmicroscopie (TEM). Wat kan je met beide
technieken onderzoeken? Hoe moet het te onderzoeken weefsel voorbewerkt worden voor deze methoden en
waarom?
We gebruiken microscopen om objecten te bestuderen die te klein zijn om met het blote oog te zien.
De lichtmicroscoop maakt voor de vergrote afbeelding gebruik van zichtbaar licht. We maken gebruik van licht dat op het
object zelf valt en weerkaatst wordt (stereomicroscoop). Of met doorvallend licht (microscoop met oculairen en een objectief).
Vooral gebruikt om eerder het geheel van de cel te zien, bijvoorbeeld waarnemen van de mitose/meiose tot 0.2 micrometer.
Om cellen te kunnen zien zonder kleurstof te gebruiken, wordt ‘faze contrast’ microscopie gebruikt. Objecten worden
weergegeven door donkere en lichtere banden door meer of minder verstrooiing van licht.
Indien we wel kleurstof gebruiken spreken we van uorescentie microscopie. Licht van een speci eke gol engte wordt
gebruikt om uorescente moleculen te laten oplichten. Hiervoor worden uorescente eiwitten gebruikt.
Weefselpreparatie:
De cellulaire structuur moet eerst een aantal bewerkingen doorlopen.
1. Bewaren en xeren van weefsel ( invriezen of xeren)
2. Vervaardigen van weefselcoupes —> via paraf ne, dan versnijden
3. Kleuren van de weefselsnedes
Bij TEM worden elektronen door een preparaat geschoten en opgevangen door een gevoelige plaat. Waar weefsel dikker,
meeste verstrooiing van elektronen.
We bestuderen hier intracellulaire structuren mee tot minder dan 0.1nm, dit is dan ultrastructuur. Virussen, DNA, afzonderlijke
moleculen, …
Weefselpreparatie:
Er moeten zeer dunnen coupes gemaakt worden (0.1 micrometer). De ge xeerde weefsels worden ingebed door epoxyhars
en moeten gesneden worden met een diamant-/glasmes.
Een tweede xatie zorgt voor de ‘kleuring’ van het weefsel. Oso4 maakt het weefsel zwaarder waardoor een donkerdere kleur
bij meer massa weefsel (er is meer verstrooiing van elektronen).
Waarom voorbewerking?
Het weefsel moet bewaard worden opdat de oorspronkelijke toestand zoveel mogelijk bewaard blijft (zowel chemisch als
structureel). Afbraak processen moeten worden afgeremd. Macromoleculaire structuur moet intact worden gehouden.
LICHT ELEKTRON
BRON
BRON
CONDENSATOR CONDENSATOR
LENS LENS
&
LICHT S
STAAL STAAL
&
S
TEM
I I
I I
OBJECTIEVE OBJECTIEVE
LENS
/
LENS
EYE PIECE
/ [
PROJECTIE
LENS LENS
-
& 7 BEELD BEELD
7
fl
fi fi fifl
fi fl fi
, 2. Bespreek de “ xatie” aan de hand van formaldehyde en glutaraldehyde bij de staalpreparatie voor histologie. Voor
welke histologische methoden worden deze gebruikt?
Om weefsel te xeren wordt het ondergedompeld in een xatievloeistof (= xator) waardoor er covalente bindingen worden
gevormd met de N-terminale groepen van eiwitten, volgens crosslinking.
De eiwitten worden aan het cytoskelet en hun interagerende eiwitten vastgehecht waardoor de structuur zoveel mogelijk
bewaard blijft. De meeste enzymen verliezen ook hun werking.
Duurt 2 tot 24 uur. De hoeveelheid xator moet minimaal 5X het volume zijn van het weefsel.
Voor lichtmicroscopie:
Meest gebruikte xator is formol, een waterige oplossing op basis van formaldhyde. De nadelen hieraan zijn dat DNA en RNA
ook gecrosslinked kunnen worden. Dit is omkeerbaar maar de nucleïnezuren worden dan vaak gefragmenteerd en dan is
genetische analyse vaak niet meer mogelijk.
Het ge xeerde weefsel is zacht en kan niet aangesneden worden dus wordt ingebed in paraf ne. (Paraf ne heeft hydrofobe
eigenschappen dus dit mag niet zomaar worden gemengd. Het weefsel wordt eerst ontdaan van water, dan uitgespoeld met
tolueen of xyleen). Door paraf ne is het een harde blok geworden die we kunnen aansnijden met een microtoom.
Fragmenten zijn 5-10 micrometer
11
coupes
Voor elektronenmicroscopie:
Nadat de cellen zijn gescheiden van hun bloedvoorziening zal er osmotische zwelling optreden dus moeten we snel en goed
xeren. De xatie gebeurt in gekoelde glutaaraldehyde (4°) en wordt gevolgd door een tweede xatie in OsO4 om vetten te
bewaren en gewicht toe te voegen waardoor bepaalde plaatsen in het weefsel beter zichtbaar zijn.
Fragmenten zijn max. 1-2mm groot.
Voor TEM moeten dunne coupes gesneden worden (1 micrometer), hiervoor worden de ge xeerde weefsels nog eens
ingebed in epoxyhars. Nu kunnen de coupes gesneden worden door een diamant of glasmes.
FORMALDEHYDE :
HzC = 0 + H20 >
HOCHzOH
GLUTAARALDEHYDE :
W W
11
fi fi fi fi fifi fi fi fi fi
,3. Geef de gelijkenissen en verschillen tussen immunohistochemie en immuno uorescentie.
Immunochemische kleuringen maken gebruik van de speci eke binding van antistoffen en antigenen.
Antigenen = lichaamsvreemde/-eigen stoffen
Antistoffen = afweerproducten tegen antigenen gemaakt door het immunologisch afweersysteem
● af niteit van een antistof
● Speci citeit
● Sensitiviteit
Wanneer een bepaald antigeen in de weefselcoupe aanwezig is, zal een antistof een immuuncomplex vormen thv dit
antigeen. De antistof wordt gebonden aan een uorescerende molecule, enzym, biotisch of goudpartikel.
Immunohistochemie:
In het weefsel brengen we primaire/secundaire antistoffen en geven de tijd om zich te binden aan het antigeen die we willen
bestuderen. Een actief enzym zal reageren en omgezet worden naar een bruin precipitaat op de plaats waar het antigen
gebonden is. Zo kan er bepaald worden waar het antigen zich bevindt. Er kan maar 1 antigeen worden gevisualiseerd.
Met biotine: antistof gelabeld ,daarna uorofoor complex toegevoegd met hoge af niteit voor biotine
Met goud: = zwaar ==> TEM
Immunohisto uorescentie:
De antigenen worden herkend doordat de primaire/secundaire antistoffen zijn gekoppeld aan een uorofoor (geeft licht bij
beschijnen). Er kunnen verschillende antigenen worden gevisualiseerd omdat we meerdere uoroforen kunnen gebruiken.
Doel beide: aantonen en lokaliseren van een antigeen met behulp van speci eke antistoffen in weefselcoupes. Onderzoek op
eiwitniveau.
* ⑧ variabel
antigen bindt hier
constant
fi fi fl fl fl fi
, 4. Bespreek directe, indirecte en geampi ceerde immunohistochemie en immuno uorescentie. Waarom bestaan
deze verschillende afgeleide methoden?
Direct: het primaire antistof is zelf gelabeld. Techniek is snel, eenvoudig maar weinig signaalversterking en lage hoeveelheden
antigeen worden moeilijk gedetecteerd.
Meest gebruikt om immuunglobuline en complementdeposities op te sporen in huid- en nierpuncties.
Beste resultaat is in virescoupes met uoresceïne.
Indirect: primaire antistof is niet gelabeld. Tweede antistof is wel gelabeld en bindt met zijn variabele deel aan het constante
deel van de antistof, dit leidt tot een kleuring of uorescent signaal.
Gevoeliger want meerdere bindingsplaatsen voor het secundaire op het primaire.
Meer signaal per bindingsplaats van het primair antilichaam met antigeen.
Speci eker, exibel. Ef ciënter.
Ampli catie: secundaire antistof bindt met zijn variabel deel aan het variabel deel van een primair antistof.
Door streptavidin kunnen veel uorescente eiwitten binden wat zorgt voor signaalversterking.
Twee antistoffen kunnen zeer sterk met elkaar interageren en vormen grote complexen.
5. Welke verwerkingsstappen doorloopt een weefselstukje tussen resectie tijdens operatie en diagnostiek middels
lichtmicroscopie? Licht iedere stap toe.
1) Fixatie. Meteen na resectie moet het stukje weefsel snel en goed worden ge xeerd. Het wordt ondergedompeld in een
xator om de macromoleculaire structuur zo intact mogelijk te houden.
De meest gebruikte xator is formol.
2) Inbedding. Het weefsel is nu nog zacht dus wordt ingebed in paraf ne. De xator mag niet zomaar gemengd worden met
paraf ne en daarom wordt het weefsel eerst ontdaan van water en nadien gespoeld met tolueen/xyleen. Als de paraf ne is
opgesteven is het een harde blok die aangesneden kan worden.
3) Snijden. Het weefsel wordt gesneden met een microtoom. Ze zijn 5-10 micrometer dik.
4) Kleuren. De weefselcoupes kunnen nu gekleurd worden zodat bepaalde celbestanddelen speci ek aan te tonen zijn.
Voorbeeld van kleuring is de Haematoxyline-Eosine kleuring.
5) Microscopische analyse. De weefselcoupes worden onderzocht onder de lichtmicroscoop.
(Of invriezen. Het weefsel wordt dan in een OCT-oplossing ingevroren aan de hand van onderkoeld isopentaan. Nadien wordt
het aangesneden met een gekoeld microtoom in vriescoupes. Heeft dus geen inbedding nodig en kan meteen gekleurd
worden.)
fi
fifi fl fi fi fl fl fi fl fi
1. Vergelijk conventionele lichtmicroscopie met de transmissie elektronenmicroscopie (TEM). Wat kan je met beide
technieken onderzoeken? Hoe moet het te onderzoeken weefsel voorbewerkt worden voor deze methoden en
waarom?
We gebruiken microscopen om objecten te bestuderen die te klein zijn om met het blote oog te zien.
De lichtmicroscoop maakt voor de vergrote afbeelding gebruik van zichtbaar licht. We maken gebruik van licht dat op het
object zelf valt en weerkaatst wordt (stereomicroscoop). Of met doorvallend licht (microscoop met oculairen en een objectief).
Vooral gebruikt om eerder het geheel van de cel te zien, bijvoorbeeld waarnemen van de mitose/meiose tot 0.2 micrometer.
Om cellen te kunnen zien zonder kleurstof te gebruiken, wordt ‘faze contrast’ microscopie gebruikt. Objecten worden
weergegeven door donkere en lichtere banden door meer of minder verstrooiing van licht.
Indien we wel kleurstof gebruiken spreken we van uorescentie microscopie. Licht van een speci eke gol engte wordt
gebruikt om uorescente moleculen te laten oplichten. Hiervoor worden uorescente eiwitten gebruikt.
Weefselpreparatie:
De cellulaire structuur moet eerst een aantal bewerkingen doorlopen.
1. Bewaren en xeren van weefsel ( invriezen of xeren)
2. Vervaardigen van weefselcoupes —> via paraf ne, dan versnijden
3. Kleuren van de weefselsnedes
Bij TEM worden elektronen door een preparaat geschoten en opgevangen door een gevoelige plaat. Waar weefsel dikker,
meeste verstrooiing van elektronen.
We bestuderen hier intracellulaire structuren mee tot minder dan 0.1nm, dit is dan ultrastructuur. Virussen, DNA, afzonderlijke
moleculen, …
Weefselpreparatie:
Er moeten zeer dunnen coupes gemaakt worden (0.1 micrometer). De ge xeerde weefsels worden ingebed door epoxyhars
en moeten gesneden worden met een diamant-/glasmes.
Een tweede xatie zorgt voor de ‘kleuring’ van het weefsel. Oso4 maakt het weefsel zwaarder waardoor een donkerdere kleur
bij meer massa weefsel (er is meer verstrooiing van elektronen).
Waarom voorbewerking?
Het weefsel moet bewaard worden opdat de oorspronkelijke toestand zoveel mogelijk bewaard blijft (zowel chemisch als
structureel). Afbraak processen moeten worden afgeremd. Macromoleculaire structuur moet intact worden gehouden.
LICHT ELEKTRON
BRON
BRON
CONDENSATOR CONDENSATOR
LENS LENS
&
LICHT S
STAAL STAAL
&
S
TEM
I I
I I
OBJECTIEVE OBJECTIEVE
LENS
/
LENS
EYE PIECE
/ [
PROJECTIE
LENS LENS
-
& 7 BEELD BEELD
7
fl
fi fi fifl
fi fl fi
, 2. Bespreek de “ xatie” aan de hand van formaldehyde en glutaraldehyde bij de staalpreparatie voor histologie. Voor
welke histologische methoden worden deze gebruikt?
Om weefsel te xeren wordt het ondergedompeld in een xatievloeistof (= xator) waardoor er covalente bindingen worden
gevormd met de N-terminale groepen van eiwitten, volgens crosslinking.
De eiwitten worden aan het cytoskelet en hun interagerende eiwitten vastgehecht waardoor de structuur zoveel mogelijk
bewaard blijft. De meeste enzymen verliezen ook hun werking.
Duurt 2 tot 24 uur. De hoeveelheid xator moet minimaal 5X het volume zijn van het weefsel.
Voor lichtmicroscopie:
Meest gebruikte xator is formol, een waterige oplossing op basis van formaldhyde. De nadelen hieraan zijn dat DNA en RNA
ook gecrosslinked kunnen worden. Dit is omkeerbaar maar de nucleïnezuren worden dan vaak gefragmenteerd en dan is
genetische analyse vaak niet meer mogelijk.
Het ge xeerde weefsel is zacht en kan niet aangesneden worden dus wordt ingebed in paraf ne. (Paraf ne heeft hydrofobe
eigenschappen dus dit mag niet zomaar worden gemengd. Het weefsel wordt eerst ontdaan van water, dan uitgespoeld met
tolueen of xyleen). Door paraf ne is het een harde blok geworden die we kunnen aansnijden met een microtoom.
Fragmenten zijn 5-10 micrometer
11
coupes
Voor elektronenmicroscopie:
Nadat de cellen zijn gescheiden van hun bloedvoorziening zal er osmotische zwelling optreden dus moeten we snel en goed
xeren. De xatie gebeurt in gekoelde glutaaraldehyde (4°) en wordt gevolgd door een tweede xatie in OsO4 om vetten te
bewaren en gewicht toe te voegen waardoor bepaalde plaatsen in het weefsel beter zichtbaar zijn.
Fragmenten zijn max. 1-2mm groot.
Voor TEM moeten dunne coupes gesneden worden (1 micrometer), hiervoor worden de ge xeerde weefsels nog eens
ingebed in epoxyhars. Nu kunnen de coupes gesneden worden door een diamant of glasmes.
FORMALDEHYDE :
HzC = 0 + H20 >
HOCHzOH
GLUTAARALDEHYDE :
W W
11
fi fi fi fi fifi fi fi fi fi
,3. Geef de gelijkenissen en verschillen tussen immunohistochemie en immuno uorescentie.
Immunochemische kleuringen maken gebruik van de speci eke binding van antistoffen en antigenen.
Antigenen = lichaamsvreemde/-eigen stoffen
Antistoffen = afweerproducten tegen antigenen gemaakt door het immunologisch afweersysteem
● af niteit van een antistof
● Speci citeit
● Sensitiviteit
Wanneer een bepaald antigeen in de weefselcoupe aanwezig is, zal een antistof een immuuncomplex vormen thv dit
antigeen. De antistof wordt gebonden aan een uorescerende molecule, enzym, biotisch of goudpartikel.
Immunohistochemie:
In het weefsel brengen we primaire/secundaire antistoffen en geven de tijd om zich te binden aan het antigeen die we willen
bestuderen. Een actief enzym zal reageren en omgezet worden naar een bruin precipitaat op de plaats waar het antigen
gebonden is. Zo kan er bepaald worden waar het antigen zich bevindt. Er kan maar 1 antigeen worden gevisualiseerd.
Met biotine: antistof gelabeld ,daarna uorofoor complex toegevoegd met hoge af niteit voor biotine
Met goud: = zwaar ==> TEM
Immunohisto uorescentie:
De antigenen worden herkend doordat de primaire/secundaire antistoffen zijn gekoppeld aan een uorofoor (geeft licht bij
beschijnen). Er kunnen verschillende antigenen worden gevisualiseerd omdat we meerdere uoroforen kunnen gebruiken.
Doel beide: aantonen en lokaliseren van een antigeen met behulp van speci eke antistoffen in weefselcoupes. Onderzoek op
eiwitniveau.
* ⑧ variabel
antigen bindt hier
constant
fi fi fl fl fl fi
, 4. Bespreek directe, indirecte en geampi ceerde immunohistochemie en immuno uorescentie. Waarom bestaan
deze verschillende afgeleide methoden?
Direct: het primaire antistof is zelf gelabeld. Techniek is snel, eenvoudig maar weinig signaalversterking en lage hoeveelheden
antigeen worden moeilijk gedetecteerd.
Meest gebruikt om immuunglobuline en complementdeposities op te sporen in huid- en nierpuncties.
Beste resultaat is in virescoupes met uoresceïne.
Indirect: primaire antistof is niet gelabeld. Tweede antistof is wel gelabeld en bindt met zijn variabele deel aan het constante
deel van de antistof, dit leidt tot een kleuring of uorescent signaal.
Gevoeliger want meerdere bindingsplaatsen voor het secundaire op het primaire.
Meer signaal per bindingsplaats van het primair antilichaam met antigeen.
Speci eker, exibel. Ef ciënter.
Ampli catie: secundaire antistof bindt met zijn variabel deel aan het variabel deel van een primair antistof.
Door streptavidin kunnen veel uorescente eiwitten binden wat zorgt voor signaalversterking.
Twee antistoffen kunnen zeer sterk met elkaar interageren en vormen grote complexen.
5. Welke verwerkingsstappen doorloopt een weefselstukje tussen resectie tijdens operatie en diagnostiek middels
lichtmicroscopie? Licht iedere stap toe.
1) Fixatie. Meteen na resectie moet het stukje weefsel snel en goed worden ge xeerd. Het wordt ondergedompeld in een
xator om de macromoleculaire structuur zo intact mogelijk te houden.
De meest gebruikte xator is formol.
2) Inbedding. Het weefsel is nu nog zacht dus wordt ingebed in paraf ne. De xator mag niet zomaar gemengd worden met
paraf ne en daarom wordt het weefsel eerst ontdaan van water en nadien gespoeld met tolueen/xyleen. Als de paraf ne is
opgesteven is het een harde blok die aangesneden kan worden.
3) Snijden. Het weefsel wordt gesneden met een microtoom. Ze zijn 5-10 micrometer dik.
4) Kleuren. De weefselcoupes kunnen nu gekleurd worden zodat bepaalde celbestanddelen speci ek aan te tonen zijn.
Voorbeeld van kleuring is de Haematoxyline-Eosine kleuring.
5) Microscopische analyse. De weefselcoupes worden onderzocht onder de lichtmicroscoop.
(Of invriezen. Het weefsel wordt dan in een OCT-oplossing ingevroren aan de hand van onderkoeld isopentaan. Nadien wordt
het aangesneden met een gekoeld microtoom in vriescoupes. Heeft dus geen inbedding nodig en kan meteen gekleurd
worden.)
fi
fifi fl fi fi fl fl fi fl fi
