Name and Surname: Mestdag Cara
Group: 1Cc
II. Methods and techniques in molecular biology
II.A. Genotyping of wild type and obese mice
II.A. Step 4: DNA purification
Datum: 27/02/23
Veiligheidsinformatie
Voor deze proef moet geen veiligheidsinformatie opgezocht worden, aangezien het experiment door
een assistent uitgevoerd wordt.
Procedure
Voor deze proef moet geen verwijzing naar de procedure gemaakt worden, aangezien het
experiment door een assistent uitgevoerd wordt.
Berekeningen en waarnemingen
Voor deze proef moeten geen berekeningen en waarnemingen gemaakt worden, aangezien het
experiment door een assistent uitgevoerd wordt.
Taken en vragen
1. Why is it important to evaluate the pH before applying your PCR mixture containing DNA
combined with binding buffer to a purification column?
DNA moet negatief geladen zijn om te kunnen binden met de silica-matrix. Daarvoor is een
zure pH nodig. Indien de pH te basisch zou zijn zal DNA niet de juiste lading hebben en kan de
binding met de silica-matrix niet plaatsvinden. Stel dat de binding niet heeft plaatsgevonden
dan zal het DNA wegwassen. Er kan dan geen DNA-opzuivering gebeuren.
2. What is the effect of the chaotropic reagent in the binding buffer?
Het chaotroop zout bevat natriumionen, die een zoutbrug gaan vormen tussen het
silicamembraan en het DNA. Bijkomend zorgt het zout er ook voor dat de waterlaag rondom
het DNA en het silicamembraan wegtrekt.
3. How do we elute DNA from the purification column?
Door te elueren met een buffer met lage zoutconcentratie en een hoge pH. De dalende
zoutconcentratie zorgt ervoor dat DNA niet meer kan binden aan de natriumionen. De
stijgende pH heeft een effect op de geladen groepen en zorgt ervoor dat de bindingen met
DNA zwakker worden.
1
, Name and Surname: Mestdag Cara
Group: 1Cc
II. Methods and techniques in molecular biology
II.A. Genotyping of wild type and obese mice
II.A. Step 5: DNA sequencing
Datum: 27/02/23
Veiligheidsinformatie
Voor deze proef moet geen veiligheidsinformatie opgezocht worden, aangezien het experiment door
een assistent uitgevoerd wordt.
Procedure
Voor deze proef moet geen verwijzing naar de procedure gemaakt worden, aangezien het
experiment door een assistent uitgevoerd wordt.
Berekeningen en waarnemingen
Voor deze proef moeten geen berekeningen en waarnemingen gemaakt worden, aangezien het
experiment door een assistent uitgevoerd wordt.
Taken en vragen
1. Examine the results of the sequencing using the basic local alignment search tool (BLAST)
(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Which sample corresponds to DNA from wt and
which with DNA from ob/ob mice? Argument. Provide a screenshot of the output.
We hebben BLAST1 gebruikt om de nucleotidesequenties van de samples te vergelijken met
de biologische sequenties van de muis. Tabel 1: Screenshot of analysis geeft de resultaten van
de test weer op de volgende bladzijde. De bovenstaande sequentie geeft de sequentie van de
samples weer. De onderste sequentie geeft de biologische sequentie van een wilde muis weer.
Aangeduid in het blauw op Figuur 1: BLAST resultaten sample 1 en Figuur 1: BLAST resultaten
sample 2 is de plaats waar de puntmutatie plaatsvindt bij ob/ob muis. Bij sample 1 zien we op
deze plek een cytosine (C), dit komt overeen met de sequentie van een wilde muis. Bij sample
2 zien we echter op diezelfde plek een thymine (T).
We kunnen dus besluiten dat sample 1 het DNA van een wt muis weergeeft en sample 2 dat
van een ob/ob muis.
1
Blast: Basic local alignment search tool. https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi (accessed Mar 2, 2023).
2
Group: 1Cc
II. Methods and techniques in molecular biology
II.A. Genotyping of wild type and obese mice
II.A. Step 4: DNA purification
Datum: 27/02/23
Veiligheidsinformatie
Voor deze proef moet geen veiligheidsinformatie opgezocht worden, aangezien het experiment door
een assistent uitgevoerd wordt.
Procedure
Voor deze proef moet geen verwijzing naar de procedure gemaakt worden, aangezien het
experiment door een assistent uitgevoerd wordt.
Berekeningen en waarnemingen
Voor deze proef moeten geen berekeningen en waarnemingen gemaakt worden, aangezien het
experiment door een assistent uitgevoerd wordt.
Taken en vragen
1. Why is it important to evaluate the pH before applying your PCR mixture containing DNA
combined with binding buffer to a purification column?
DNA moet negatief geladen zijn om te kunnen binden met de silica-matrix. Daarvoor is een
zure pH nodig. Indien de pH te basisch zou zijn zal DNA niet de juiste lading hebben en kan de
binding met de silica-matrix niet plaatsvinden. Stel dat de binding niet heeft plaatsgevonden
dan zal het DNA wegwassen. Er kan dan geen DNA-opzuivering gebeuren.
2. What is the effect of the chaotropic reagent in the binding buffer?
Het chaotroop zout bevat natriumionen, die een zoutbrug gaan vormen tussen het
silicamembraan en het DNA. Bijkomend zorgt het zout er ook voor dat de waterlaag rondom
het DNA en het silicamembraan wegtrekt.
3. How do we elute DNA from the purification column?
Door te elueren met een buffer met lage zoutconcentratie en een hoge pH. De dalende
zoutconcentratie zorgt ervoor dat DNA niet meer kan binden aan de natriumionen. De
stijgende pH heeft een effect op de geladen groepen en zorgt ervoor dat de bindingen met
DNA zwakker worden.
1
, Name and Surname: Mestdag Cara
Group: 1Cc
II. Methods and techniques in molecular biology
II.A. Genotyping of wild type and obese mice
II.A. Step 5: DNA sequencing
Datum: 27/02/23
Veiligheidsinformatie
Voor deze proef moet geen veiligheidsinformatie opgezocht worden, aangezien het experiment door
een assistent uitgevoerd wordt.
Procedure
Voor deze proef moet geen verwijzing naar de procedure gemaakt worden, aangezien het
experiment door een assistent uitgevoerd wordt.
Berekeningen en waarnemingen
Voor deze proef moeten geen berekeningen en waarnemingen gemaakt worden, aangezien het
experiment door een assistent uitgevoerd wordt.
Taken en vragen
1. Examine the results of the sequencing using the basic local alignment search tool (BLAST)
(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Which sample corresponds to DNA from wt and
which with DNA from ob/ob mice? Argument. Provide a screenshot of the output.
We hebben BLAST1 gebruikt om de nucleotidesequenties van de samples te vergelijken met
de biologische sequenties van de muis. Tabel 1: Screenshot of analysis geeft de resultaten van
de test weer op de volgende bladzijde. De bovenstaande sequentie geeft de sequentie van de
samples weer. De onderste sequentie geeft de biologische sequentie van een wilde muis weer.
Aangeduid in het blauw op Figuur 1: BLAST resultaten sample 1 en Figuur 1: BLAST resultaten
sample 2 is de plaats waar de puntmutatie plaatsvindt bij ob/ob muis. Bij sample 1 zien we op
deze plek een cytosine (C), dit komt overeen met de sequentie van een wilde muis. Bij sample
2 zien we echter op diezelfde plek een thymine (T).
We kunnen dus besluiten dat sample 1 het DNA van een wt muis weergeeft en sample 2 dat
van een ob/ob muis.
1
Blast: Basic local alignment search tool. https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi (accessed Mar 2, 2023).
2
