MICROBIËLE DIAGNOSTIEK
ORAAL MICROBIOOM
® 700 soorten bacteriën in de mond (100 - 150 per persoon, 50 per site)
® Aanwezig als plaque op hard en zacht weefsel
® 1 - 1,3x bacteriën per menselijke cel (vooral in darmen)
® 70% van plaque bestaat uit bacteriën
® 1010 bacteriën in de mond
PLAQUE ALS OORZAAK VAN PARODONTITIS EN CARIËS
Er hebben verschillende ‘hypothesen’ bestaan over wat de oorzaken zijn van parodontitis en cariës
® Aspecifieke plaque (voor jaren ’70)
WAT hoeveelheid plaque = risicofactor voor parodontitis/cariës
® Specifieke plaque (na jaren ’70 - 2003)
WAT specifieke bacteriën/pathogenen in de plaque = risicofactor voor parodontitis/cariës
• P. Gingivalis (Pg)
• T. Forsynthia (Tf)
• T. Denticola (Td)
® Ecologische plaque & polymicrobiële synergie and dysbiose (2003 - nu)
• De gehele biofilm (niet 1 ziekteverwekker) = risicofactor voor parodontitis/cariës
• Immunologische reactie van de gastheer speelt een rol (gevoelig/ongevoelig)
• Gezonde samenstelling VS ongezonde samenstelling van de plaque (oud = ongezond)
PAROPATHOGENEN
® A.a. = Aggregatibacter actinomycetemcomitans
• Vernietigt leukocyten
• Verminderde immuunrespons
® P.g. = Porfyromonas gingivalis
• Vernietigt IL-8 = chemokine paralyse
CARIOPATHOGENEN
® Streptococcus mutans
® Streptococcus sobrinus
FUNCTIE
,MORFOLOGIE VIA MICROSCOPIE
Bacteriën = prokaryoot " hebben een celmembraan en een plasmamembraan + geen celkern
Dieren = eukaryoot " hebben geen celmembraan (enkel plasmamembraan) + wel celkern
Gramkleuring m.b.v.
® crystal violet
® Fafranin/fushine (kleurt alles maar minder fel van crystal violet)
Deze kleuringen kosten tijd & bacteriën gaan DOOD
Oplossing?
® Bright field (kleuring nodig)
® Dark field (geen kleuring en bacteriën leven nog)
® Phase contrast (geen kleuring en bacteriën leven nog)
ANALYSE VAN EEN STAAL
® Coccen (bolvormig)
® Spirocheten (kurkentrekker)
® Bacilii (staafjes)
® Filamenten
® Beweeglijkheid
Wat zit er in gezonde stalen?
® Veel cocci (> 75%)
® Niet beweeglijk
Wat zit er in ongezonde stalen?
® Veel spirocheten (>/= 15%) en/of >/= 15% is beweeglijk
,CANDIDA
® Schimmel/fungus
® Grote cellen i.v.m. bacteriën
® Geel/oranje kleur (bacteriën kleuren groen)
® Gesegmenteerde hyphen
® Natuurlijk commensaal (in van nature in/op de gastheer aanwezig) MAAR onnatuurlijke uitgroei
= candidiasis
EIGENSCHAPPEN BACTERIËN
Bacteriën kunnen groeien in een ‘rijk groei medium’ WAT bloedplaten met hemine en Vitamine K
! Niet alle bacteriën kunnen gekweekt worden
In een staal: 8 miljard cellen/bacteriën (niet telbaar op plaat/microscoop maar m.b.v. verdunningen)
ZUURSTOF
® Strikt aeroob: hoge zuurstof vereisten (groeien anders niet)
® Facultatief anaeroob: kunnen zowel groeien met als zonder zuurstof
® Strikt anaeroob: verdragen geen zuurstof
In gingivale pocket " anaerobe omstandigheden in biofill op < 1 mm diep (21% O2 " 0% O2)
REDENEN
® Slechte diffusie van O2 doorheen biofilm
® O2 wordt verbruikt door aerobe bacteriën bovenaan in de biofilm
KWEEK
Voordelen
® Duidelijke eigenschappen " herkenbaar
® Tellen van bacteriën
® Geïsoleerde bacteriën kunnen verder onderzocht worden
Nadelen
® Traag
® Verwante species moeilijk te onderscheiden
® Niet alle bacteriën zijn te kweken
POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)
WAT DNA kopieermachine (in elk organisme)
1 Denaturatie (95° C)
2 Primer aanhechting (60° C)
3 DNA aanmaak (72° C)
, AGAROSE GEL ELECTROPHORESE (AGE)
DNA = negatief geladen DUS wordt aangetrokken naar positieve elektrode (anode)
GEVOLG DNA wordt gevisualiseerd m.b.v. bindende stoffen (ethidium bromide)
HOE langer het DNA HOE moeilijker het doorheen de gel beweegt (tragere migratie)
! M.b.v. specifieke primers kan je organismen van elkaar onderscheiden
Voordelen (PCR en AGE)
® Heel specifiek bacteriën herkennen
® Snel
® Ook dode & moeilijk groeiende bacteriën detecteren
Nadelen (PCR en AGE)
® Hoeveel bacteriën?
® Er moeten primers ontwikkeld zijn
® DNA tussen verwante soorten verschilt vaak niet genoeg
QPCR
Elke bacterie heeft ongeveer evenveel DNA
DUS hoeveelheid DNA geeft ons informatie over de hoeveelheid bacteriën
! DNA kwantificeren m.b.v. fluorescentie
Patiënt 1 = B
Patiënt 2 = A
Meer bacterien " meer DNA " minder cycli
NEXT GENERATION SEQUENCING
WAT in kaart brengen van het genoom/microbioom van de mens
Voordelen
® Exacte bepaling van DNA van alle organismen
® Technologie is snel aan het verbeteren!
Nadelen
® Nog vrij duur & traag (mag & kan beter)
ORAAL MICROBIOOM
® 700 soorten bacteriën in de mond (100 - 150 per persoon, 50 per site)
® Aanwezig als plaque op hard en zacht weefsel
® 1 - 1,3x bacteriën per menselijke cel (vooral in darmen)
® 70% van plaque bestaat uit bacteriën
® 1010 bacteriën in de mond
PLAQUE ALS OORZAAK VAN PARODONTITIS EN CARIËS
Er hebben verschillende ‘hypothesen’ bestaan over wat de oorzaken zijn van parodontitis en cariës
® Aspecifieke plaque (voor jaren ’70)
WAT hoeveelheid plaque = risicofactor voor parodontitis/cariës
® Specifieke plaque (na jaren ’70 - 2003)
WAT specifieke bacteriën/pathogenen in de plaque = risicofactor voor parodontitis/cariës
• P. Gingivalis (Pg)
• T. Forsynthia (Tf)
• T. Denticola (Td)
® Ecologische plaque & polymicrobiële synergie and dysbiose (2003 - nu)
• De gehele biofilm (niet 1 ziekteverwekker) = risicofactor voor parodontitis/cariës
• Immunologische reactie van de gastheer speelt een rol (gevoelig/ongevoelig)
• Gezonde samenstelling VS ongezonde samenstelling van de plaque (oud = ongezond)
PAROPATHOGENEN
® A.a. = Aggregatibacter actinomycetemcomitans
• Vernietigt leukocyten
• Verminderde immuunrespons
® P.g. = Porfyromonas gingivalis
• Vernietigt IL-8 = chemokine paralyse
CARIOPATHOGENEN
® Streptococcus mutans
® Streptococcus sobrinus
FUNCTIE
,MORFOLOGIE VIA MICROSCOPIE
Bacteriën = prokaryoot " hebben een celmembraan en een plasmamembraan + geen celkern
Dieren = eukaryoot " hebben geen celmembraan (enkel plasmamembraan) + wel celkern
Gramkleuring m.b.v.
® crystal violet
® Fafranin/fushine (kleurt alles maar minder fel van crystal violet)
Deze kleuringen kosten tijd & bacteriën gaan DOOD
Oplossing?
® Bright field (kleuring nodig)
® Dark field (geen kleuring en bacteriën leven nog)
® Phase contrast (geen kleuring en bacteriën leven nog)
ANALYSE VAN EEN STAAL
® Coccen (bolvormig)
® Spirocheten (kurkentrekker)
® Bacilii (staafjes)
® Filamenten
® Beweeglijkheid
Wat zit er in gezonde stalen?
® Veel cocci (> 75%)
® Niet beweeglijk
Wat zit er in ongezonde stalen?
® Veel spirocheten (>/= 15%) en/of >/= 15% is beweeglijk
,CANDIDA
® Schimmel/fungus
® Grote cellen i.v.m. bacteriën
® Geel/oranje kleur (bacteriën kleuren groen)
® Gesegmenteerde hyphen
® Natuurlijk commensaal (in van nature in/op de gastheer aanwezig) MAAR onnatuurlijke uitgroei
= candidiasis
EIGENSCHAPPEN BACTERIËN
Bacteriën kunnen groeien in een ‘rijk groei medium’ WAT bloedplaten met hemine en Vitamine K
! Niet alle bacteriën kunnen gekweekt worden
In een staal: 8 miljard cellen/bacteriën (niet telbaar op plaat/microscoop maar m.b.v. verdunningen)
ZUURSTOF
® Strikt aeroob: hoge zuurstof vereisten (groeien anders niet)
® Facultatief anaeroob: kunnen zowel groeien met als zonder zuurstof
® Strikt anaeroob: verdragen geen zuurstof
In gingivale pocket " anaerobe omstandigheden in biofill op < 1 mm diep (21% O2 " 0% O2)
REDENEN
® Slechte diffusie van O2 doorheen biofilm
® O2 wordt verbruikt door aerobe bacteriën bovenaan in de biofilm
KWEEK
Voordelen
® Duidelijke eigenschappen " herkenbaar
® Tellen van bacteriën
® Geïsoleerde bacteriën kunnen verder onderzocht worden
Nadelen
® Traag
® Verwante species moeilijk te onderscheiden
® Niet alle bacteriën zijn te kweken
POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)
WAT DNA kopieermachine (in elk organisme)
1 Denaturatie (95° C)
2 Primer aanhechting (60° C)
3 DNA aanmaak (72° C)
, AGAROSE GEL ELECTROPHORESE (AGE)
DNA = negatief geladen DUS wordt aangetrokken naar positieve elektrode (anode)
GEVOLG DNA wordt gevisualiseerd m.b.v. bindende stoffen (ethidium bromide)
HOE langer het DNA HOE moeilijker het doorheen de gel beweegt (tragere migratie)
! M.b.v. specifieke primers kan je organismen van elkaar onderscheiden
Voordelen (PCR en AGE)
® Heel specifiek bacteriën herkennen
® Snel
® Ook dode & moeilijk groeiende bacteriën detecteren
Nadelen (PCR en AGE)
® Hoeveel bacteriën?
® Er moeten primers ontwikkeld zijn
® DNA tussen verwante soorten verschilt vaak niet genoeg
QPCR
Elke bacterie heeft ongeveer evenveel DNA
DUS hoeveelheid DNA geeft ons informatie over de hoeveelheid bacteriën
! DNA kwantificeren m.b.v. fluorescentie
Patiënt 1 = B
Patiënt 2 = A
Meer bacterien " meer DNA " minder cycli
NEXT GENERATION SEQUENCING
WAT in kaart brengen van het genoom/microbioom van de mens
Voordelen
® Exacte bepaling van DNA van alle organismen
® Technologie is snel aan het verbeteren!
Nadelen
® Nog vrij duur & traag (mag & kan beter)
