hoorcollege samenvatting CW

CW hoorcollege samenvatting Seline Donkers




Van cel tot weefsel
Hoorcollege 1
Cellen zijn functionele eenheden van leven.
Eencelligen: één enkele cel is voldoende om een levend individu te maken àbeperkte
aanpassingsmogelijkheden

Meercelligen: het voordeel is dat cellen zich meer en beter kunnen specialiseren àtaakverdeling en
meer aanpassingsmogelijkheden

Microscopie:
 Vergroting, contrast en resolutie
 Lichtmicroscopie (resolutie 200 nm): bright
field, geavanceerde lichtmicroscopie en
fluorescentie microscopie
 Elektronenmiscroscopie (resolutie 1 nm):
scanning en transmissie

LM: zijn 3 benodigdheden: een fel licht moet op een
preparaat schijnen; preparaat moet doorlaatbaar zijn;
geschikte set lenzen nodig.

Verhogen van contrast met kleuringen
HE-kleuring:
 Hematoxyline (blauw tot paars):
o Bindt aan negatief geladen moleculen (DNA, RNA en glycoproteinen)
o Positief geladen
 Eosine (roze tot rood):
o Bindt aan positief geladen moleculen zoals eiwitten in bepaalde secretiegranula
o Negatief geladen.

Maken van coupes:
 Fixeren
 Inbedden in een matrix
 Coupes maken (enkele um dik)
 Kleuren

De plasmamembraan is ~7 nm dik en lichtmicroscopisch dus alleen
zichtbaar wanneer deze schuin is aangesneden.

Fase contrast microscoop
 Wordt gebruikt o.a. voor het bestuderen van een levende
ongekleurde cel
 Achtergrond belichting wordt gescheiden van door het object verstrooide licht
 Contrast door verschuiving in de fase van lichtgolven van passerend licht

Fluorescentie-microscopie: voor detectie van specifieke moleculen:
 Fluorophore kunnen direct of indirect aan een specifiek molecuul worden gekoppeld
 Geschikt voor lokalisatie van die specifieke moleculen, ook in zeer kleine structuren
 Gelijktijdig gebruik meerdere fluorochromen mogelijk
1

,CW hoorcollege samenvatting Seline Donkers


 Toepasbaar zowel op gefixeerde als op levende cellen

Fixeren àinbedden en coupes maken àpermeabiliseren van
membranen àimmuno-labelen met specifieke antilichamen
àlabelen van 1e antilichaam met 2e fluorescent antilichaam
àfluorescentie-microscopie

Voor resolutie < 200 nm elektronen microscopie
Scanning elektronen-microscopie: Detectie oppervlakte van
structuur
 Weefsel of cellen chemisch fixeren
 Geen coupes maken
 Opdampen met zwaar metaal  verstrooiing elektronen  dingen zien




Transmissie elektronen-microscopie: detectie structuur in een dun plakje
Fixeren met een aldehyde àinbedden en coupes maken à(immuno-labelen met goud bolletjes)
àcontrasteren met zout oplossing van zwaar metaal
 Chemisch fixeren met een aldehyde
 Inbedden in een matrix (b.v. plastic)
 Coupes (plakjes) maken
 Optioneel: immuno-labelen met goud bolletjes
 Contrasteren met zoutoplossing van een zwaar metaal

Detectie van een specifiek eiwit met elektronen-microscopie
 Fixeren
 Inbedden en dunne coupes maken (voor TEM)
 Immuno-labelen met specifieke antilichamen
 Labelen van 1e antilichaam of 2e antilichaam met colloidaal goud bolletje
 Contrasteren met zout van zwaar metaal
 Transmissie elektronen microscopie

Productie van polyclonale antilichamen
1. Injecting antigen into rabbit
2. Antigen activates B-cells
3. Plasma b-cells produce polyclonal antibodies
4. Obtain antiserum from rabbit containing polyclonal antibodies.




2

,CW hoorcollege samenvatting Seline Donkers




Productie van monoclonale antilichamen
1. Mouse challenged with antigen
2. Spleen (milt) cells fusion with myeloma cells
3. Hybridomas
4. Culture in HAT medium select for positive cells
5. Harvest monoclonal antibodies

Chemisch fixeren  permeabiliseren  labelen
Detectie van een specifiek antigen met fluorescente antilichamen
 Weefsel of cellen fixeren
 Weefsel inbedden en coupes maken (niet nodig voor losse cellen)
 Permeabiliseren van membrane met detergents
 Immuno-labelen met antigen specifieke fluorescente antilichamen
 Fluorescentie-microscopie

Volgen van eiwitten in levende cellen met fluorescente eiwitten.
 Sommige dieren maken green fluorescent protein (GFP). Dit is een eiwit dat van zichzelf
fluorescerend is. Deze kan geïsoleerd worden en geplakt worden aan een gen (actinegen).
Deze wordt in cel geplaatst  mRNA wordt gemaakt  je hebt 1 stuk actine en 1 stuk
fluorescent eiwit. Zo kan je een cel fluorescerend maken en dus zien waar eiwit in cel
bevindt.

Specifieke celtypen zichtbaar maken met fluorescente eiwitten door genetische manipulatie

Hoorcollege 2 Subcellulaire opbouw
Relevantie voor ziektes:
 Alle ziekteprocessen vinden hun oorsprong in cellen of leiden tot beschadiging van cellen
 Voor regeneratieprocessen zijn celfuncties noodzakelijk
 Daarom is het noodzakelijk om elk ziekteproces op cellulair niveau te leren begrijpen
 Daarvoor is ook kennis van het normale functioneren van cellen vereist

Prokaryoten:
 Eencellige organismen
 Relatief simpele structuur, omgeven door binnenste (impermeabel) en buitenste
plasmamembraan (permeabel)
 Erfelijk materiaal opgeslagen in circulair DNA-molecuul
 Geen intracellulaire membranen

Eukaryoten:
3

, CW hoorcollege samenvatting Seline Donkers


 Eencellige (bv. gist) of meercellige organismen (planten en dieren)
 Complexe structuur: kern, organellen en cytoskelet
 Erfelijk materiaal opgeslagen in lineaire DNA-moleculen (chromosomen)

Evolutionair ontstaan van de kern en andere intracellulaire compartimenten:
Prokaryoot maakt een instulping in zijn plasmamembraan welke afsnoert à blaasje
Wanneer dit blaasje wordt platgedrukt ontstaat de nucleaire envelop met twee membranen à
endoplasmatisch reticulum (continu met de nucleaire envelop).
Wanneer blaasjes loslaten van het ER à Golgi en endo-/lysosoom à vacuolaire systeem

Organellen liggen in compartimenten omdat:
 Optimalisatie van een milieu, aangepast voor specifieke taken
 Scheiding opeenvolgende taken
 Vergroting membraanoppervlak voor membraan afhankelijke reacties/taken
 Evolutionair voordeel

Evolutionair ontstaan van de kern en andere compartimenten van vacuolaire systeem:




Vacuolaire systeem
 Secretie route: eiwitten naar ECM
 Endocytose route: communicatie




Mitochondriën zijn geen onderdeel van het vacuolaire systeem en zijn apart daarvan
gerevolutioneerd:
4