,
,
,
,
, Paragraaf 2.3 Mutaties
Mutaties = verandering in DNA sequentie
Oorzaak = erfelijk (inherited), tijdens replicaties, geïntroduceerd door mutagene
stoffen op straling of spontaan (acquired)
Puntmutaties komen het meest voor. Het betreft maar één nucleotide.
Veel mutaties worden weer hersteld.
Silent mutation = eiwit blijft hetzelfde door mutatie, aminozuur hetzelfde
Missense mutation = andere aminozuur komt in het eiwit door
mutatie
Nonsense mutation = stopcodon geïntroduceerd
Frameshift mutation = deletie of insertie nucleotide
Single nucleotide polymorphisms (SNPs) = variaties in sequentie
van 1 nucleotide => vaak geen effect op fenotype, soms wel
Dubbelstrengs breuken is een grote DNA schade
Oplossing: 1. Non-homologous end joining = ligatie van twee
uiteinden van DNA moleculen zonder dat er een andere DNA
molecuul als template kan dienen, dus er zijn geen andere DNA
moleculen aanwezig, ze plakken gewoon de twee uiteinden aan
elkaar. Meestal komt er dan deletie bij kijken op de gerepareerde
plek, omdat er nucleotiden ontbreken.
2. Homologous recombination = uitwisseling van nucleotiden
sequenties tussen twee identieke of vrijwel identieke DNA
sequenties.
Epigenetische veranderingen = veranderingen in chromatine, maar
niet in DNA sequentie, bijvoorbeeld methylatie van DNA en histonen Homologous
recombination
, Paragraaf 3.1 Basis van de Recombinant DNA technologie
= verschillende DNA moleculen gecombineerd worden tot 1 molecuul
Restrictieënzymen zijn afkomstig uit bacteriën, knippen DNA op specifieke
herkenningssequentie en hun herkenningssite is meestal 4 tot 6 basenparen lang
(genetisch palinsyndroom).
Functie is om bacteriën te verdedigen tegen vreemd DNA.
Twee enzymen: eentje herkent en methyleert de sequentie en de ander herkent en
knipt de sequentie.
Herkenningssite voor een restrictie enzym is vanaf het midden gespiegeld en
complementair, zoals TTCGAA.
Enzym kan op verschillende manieren in de herkenningssite knippen, als deze
asymmetrisch is, dan kunnen er sticky of cohesive uiteindes ontstaan.
Als deze symmetrisch is dan ontstaan er blunt uiteindes.
Plasmiden zijn kleine circulaire DNA moleculen die zelfstandig repliceren.
Klonerings of expressie plasmiden (coexpressie) = gekloonde kleine plasmiden
Vectoren hebben ori en multiple cloning site (MCS). Je kunt MCS openknippen en je
kunt een stuk DNA inzetten. Dat stuk DNA heet insert, plasmide een vector en het
geheel een construct.
Een vector is in de celbiologie en de moleculaire biologie de benaming voor een
middel dat gebruikt wordt om genetisch materiaal (meestal DNA) in een cel of
organisme te brengen. Er wordt een verschil gemaakt tussen klonerings- en
expressievectoren.
Een kloneringsvector is in staat om zich autonoom te repliceren. Hij kan gebruikt
worden om zg. stabiele cellijnen te maken. Dit betekent dat na deling van de cel,
zowel de moeder- als de dochtercel een kopie van de vector bevatten. De techniek is
tevens geschikt voor het maken van genetisch gemodificeerde organismen (ggo's).
Een expressievector is niet in staat om zich te repliceren. Dit soort vectoren wordt
vooral gebruikt voor het tot expressie brengen van (grote hoeveelheden) eiwit.
Vaak heeft een vector de vorm van een circulair stuk DNA (een plasmide). Maar hij
kan ook in andere vormen voorkomen. Voor grotere DNA-fragmenten wordt vaak
gebruikgemaakt van een cosmide. Er kan ook een beroep gedaan worden op
artificiële chromosomen, zoals het 'Yeast Artificial Chromosome' (YAC) of het
'Bacterial Artificial Chromosome' (BAC). In sommige gevallen gebruikt men
(bacterie)virussen.
, De blauw-wit screening is een screeningstechniek dat zorgt voor de snelle en
gemakkelijke detectie van recombinante bacteriën in vector gebaseerde moleculaire
klonering experimenten. DNA van belang wordt geligeerd in een vector. De vector
wordt dan ingebracht in een competente gastheercel levensvatbaar voor
transformatie, die vervolgens worden gekweekt in aanwezigheid van X-gal en IPTG
(voor lac Z). Getransformeerd met vectoren die recombinant DNA zal witte kolonies
te produceren; getransformeerd met niet-recombinante plasmiden (dat wil zeggen
alleen de vector) groeien tot blauwe kolonies. Deze werkwijze voor het screenen
wordt gewoonlijk uitgevoerd met een geschikte bacteriestam, maar andere
organismen zoals gist kan ook worden gebruikt.
Je hebt een gen gekloneerd met blauw-wit screening, maar je krijgt alleen maar
blauwe kolonies. Welke stap is er waarschijnlijk niet goed gegaan?
Knippen, bij plakken en transformeren ontstaan er weinig kolonies.
Andere vectoren
Bacteriofagen = virussen die bacteriën infecteren
Cosmiden = plasmiden, maar dan met een cossite. Je kunt een grotere insert
inzetten dan plasmiden
BACs (bacterial artificial chromosome) = plasmiden gebaseerd op F-factor van e.coli.
Hele grote inserts inzetten.
YACs (yeast artificial chromosome) = genetisch gemodificeerde chromosomen van
gist gekoppeld aan een plasmide. Hele grote inserts inzetten.
,
,
,
, Paragraaf 2.3 Mutaties
Mutaties = verandering in DNA sequentie
Oorzaak = erfelijk (inherited), tijdens replicaties, geïntroduceerd door mutagene
stoffen op straling of spontaan (acquired)
Puntmutaties komen het meest voor. Het betreft maar één nucleotide.
Veel mutaties worden weer hersteld.
Silent mutation = eiwit blijft hetzelfde door mutatie, aminozuur hetzelfde
Missense mutation = andere aminozuur komt in het eiwit door
mutatie
Nonsense mutation = stopcodon geïntroduceerd
Frameshift mutation = deletie of insertie nucleotide
Single nucleotide polymorphisms (SNPs) = variaties in sequentie
van 1 nucleotide => vaak geen effect op fenotype, soms wel
Dubbelstrengs breuken is een grote DNA schade
Oplossing: 1. Non-homologous end joining = ligatie van twee
uiteinden van DNA moleculen zonder dat er een andere DNA
molecuul als template kan dienen, dus er zijn geen andere DNA
moleculen aanwezig, ze plakken gewoon de twee uiteinden aan
elkaar. Meestal komt er dan deletie bij kijken op de gerepareerde
plek, omdat er nucleotiden ontbreken.
2. Homologous recombination = uitwisseling van nucleotiden
sequenties tussen twee identieke of vrijwel identieke DNA
sequenties.
Epigenetische veranderingen = veranderingen in chromatine, maar
niet in DNA sequentie, bijvoorbeeld methylatie van DNA en histonen Homologous
recombination
, Paragraaf 3.1 Basis van de Recombinant DNA technologie
= verschillende DNA moleculen gecombineerd worden tot 1 molecuul
Restrictieënzymen zijn afkomstig uit bacteriën, knippen DNA op specifieke
herkenningssequentie en hun herkenningssite is meestal 4 tot 6 basenparen lang
(genetisch palinsyndroom).
Functie is om bacteriën te verdedigen tegen vreemd DNA.
Twee enzymen: eentje herkent en methyleert de sequentie en de ander herkent en
knipt de sequentie.
Herkenningssite voor een restrictie enzym is vanaf het midden gespiegeld en
complementair, zoals TTCGAA.
Enzym kan op verschillende manieren in de herkenningssite knippen, als deze
asymmetrisch is, dan kunnen er sticky of cohesive uiteindes ontstaan.
Als deze symmetrisch is dan ontstaan er blunt uiteindes.
Plasmiden zijn kleine circulaire DNA moleculen die zelfstandig repliceren.
Klonerings of expressie plasmiden (coexpressie) = gekloonde kleine plasmiden
Vectoren hebben ori en multiple cloning site (MCS). Je kunt MCS openknippen en je
kunt een stuk DNA inzetten. Dat stuk DNA heet insert, plasmide een vector en het
geheel een construct.
Een vector is in de celbiologie en de moleculaire biologie de benaming voor een
middel dat gebruikt wordt om genetisch materiaal (meestal DNA) in een cel of
organisme te brengen. Er wordt een verschil gemaakt tussen klonerings- en
expressievectoren.
Een kloneringsvector is in staat om zich autonoom te repliceren. Hij kan gebruikt
worden om zg. stabiele cellijnen te maken. Dit betekent dat na deling van de cel,
zowel de moeder- als de dochtercel een kopie van de vector bevatten. De techniek is
tevens geschikt voor het maken van genetisch gemodificeerde organismen (ggo's).
Een expressievector is niet in staat om zich te repliceren. Dit soort vectoren wordt
vooral gebruikt voor het tot expressie brengen van (grote hoeveelheden) eiwit.
Vaak heeft een vector de vorm van een circulair stuk DNA (een plasmide). Maar hij
kan ook in andere vormen voorkomen. Voor grotere DNA-fragmenten wordt vaak
gebruikgemaakt van een cosmide. Er kan ook een beroep gedaan worden op
artificiële chromosomen, zoals het 'Yeast Artificial Chromosome' (YAC) of het
'Bacterial Artificial Chromosome' (BAC). In sommige gevallen gebruikt men
(bacterie)virussen.
, De blauw-wit screening is een screeningstechniek dat zorgt voor de snelle en
gemakkelijke detectie van recombinante bacteriën in vector gebaseerde moleculaire
klonering experimenten. DNA van belang wordt geligeerd in een vector. De vector
wordt dan ingebracht in een competente gastheercel levensvatbaar voor
transformatie, die vervolgens worden gekweekt in aanwezigheid van X-gal en IPTG
(voor lac Z). Getransformeerd met vectoren die recombinant DNA zal witte kolonies
te produceren; getransformeerd met niet-recombinante plasmiden (dat wil zeggen
alleen de vector) groeien tot blauwe kolonies. Deze werkwijze voor het screenen
wordt gewoonlijk uitgevoerd met een geschikte bacteriestam, maar andere
organismen zoals gist kan ook worden gebruikt.
Je hebt een gen gekloneerd met blauw-wit screening, maar je krijgt alleen maar
blauwe kolonies. Welke stap is er waarschijnlijk niet goed gegaan?
Knippen, bij plakken en transformeren ontstaan er weinig kolonies.
Andere vectoren
Bacteriofagen = virussen die bacteriën infecteren
Cosmiden = plasmiden, maar dan met een cossite. Je kunt een grotere insert
inzetten dan plasmiden
BACs (bacterial artificial chromosome) = plasmiden gebaseerd op F-factor van e.coli.
Hele grote inserts inzetten.
YACs (yeast artificial chromosome) = genetisch gemodificeerde chromosomen van
gist gekoppeld aan een plasmide. Hele grote inserts inzetten.
