Deel 1: Inleiding tot Recombinant DNA Technologie en PCR-methoden
Cloneringstechnieken
Type Werking
Traditional / conventionele 1) Knip gene of interest met RE
cloning 2) Plasmide knippen met dezelfde RE in MCS
3) Voeg beide samen + T4 DNA ligase (3’OH -5’P)
https://youtu.be/b9Lm2TUDN2M 4) Transformatie: hitte shock d.m.v. CaCl2, electroporatie,…
5) Selectie
- 1 insert
T-A cloning 1) Taq DNA polymerase voegt een A-overhangen aan PCR-product
2) Vector bevat T-overhang
3) Meng PCR-product + vector + T4 DNA ligase (wel ATP) of bij TOPO T-A cloning: Topoisomerase
ligase (geen ATP)
4) Transformatie
5) Meestal blauw/wit screening (lacZ α in MCS) voor onderscheiding inserts
- 1 insert
- bv: TOPO-vector
,Golden gate assembly cloning D.m.v. adaptors Dmv linkers
Ontwerp insert Ontwerp insert
https://youtu.be/EpHeu44hitI 1) Voeg adaptor (blunt – sticky) + T4 DNA ligase (ATP) 1) Voeg linker (blunt – blunt) + T4 DNA ligase (ATP)
2) Voeg polynucleotide kinase (ATP) 2) Voeg 2S RE
(niet zo belangrijk)
Maak plasmide ready Ontwerp plasmide
1) Knipt plasmide met 2S RE (halen een stuk er uit) 1) Knip plasmide met 2S RE (halen een stuk er uit)
Voeg insert en plasmide bijeen Voeg insert en plasmide bijeen
Alkalische fosfatase belet recirculatie zonder insertie vreemd DNA door verwijdering 5’P-groepen van vectoren
zonder insert
Niet-geligeerde fragmenten verwijderd door digestie bv. PlasmidSafe exonuclease
- Meerdere inserts tegelijk
IVA (in vivo assembly) Cloning 1) Ontwerp primers met 20nt homologe overhang (tailed primer)
2) PCR-amplificatie
Geen: RE, infusion enzyme 3) DpnI digestie: Verwijder gemethyleerd DNA-template
In vivo 4) Transformatie in competente bacteriën
5) Bacteriën herstellen zelf door homologe recombinatie
Single tube universele cloning system
- 1 insert tegelijk
RE vrije kloneringstechnieken
Gibson Assembly Cloning Ervoor: vector lineariseren (wel door RE) + PCR amplificatie
1) T5 Exonuclease verwijdert 5’ uiteinden van insert-> 15bp ss overhang
Wel: Ligase, DNA pol, exon = chew-back
Geen: Fosfatase, RE 2) DNA-polymerase verlengt stuk
3) DNA ligase ligeert insert en vector
https://youtu.be/etPiygqEv5E - Meerdere inserts tegelijk
RS1 RS2 ENZO HIERBIJ????????? RS1/RS2 horen bij het lineariseren van de
vector door restrictie-enzymen.
2 PCR stappen
,In fusion cloning 1) Ontwerp primers met 15bp complementariteit aan vector (dmv PCR)
2) PCR-amplificatie van fragmenten en vector (vector moet eerst lineair gemaakt worden)
Wel: In-Fusion kit 3) In-Fusion enzymmix -> verwijdert nucleotiden aan 5’
Geen: Geen RE, externe 3) Transformeer in E.Coli
ligase/polymerase, ligase
Voordelen:
Gelijkaardig aan Gibson, - In vitro
verschil: geen ligase & meestal - Slechts 15 bp overlap ipv 25
1 insert - Sneller
- 1 insert (kan meerdere, maar is minder stabiel dan in Gibson)
https://youtu.be/eBvZ7UlmyLU?list=
PLSxmk78eQiuCAT1SdhiLJmdBZCtEWTdXH
Gateway cloning = site-specifieke recombinatie-techniek gebaseerd op het λ-fage-systeem (lysogene situatie)
Overzicht: donor vector -> entry vector -> bestemmingsvector
Geen: RE, ligase
Stap 1: BP clonase: Insert in Entry Clone
https://youtu.be/e_ShyrRrufM
https://youtu.be/q3y4Xp_xuik Enzymen: Int + IHF
attB + attP → attL + attR
Stap 2: LR Clonase: Insert van Entry Clone naar Destination Vector
Enzymen: Int + IHF + Xis
attL + attR → attB + attP
ccdA: bevat anitoxine
ccdB: bevat toxine: suicide gene: toxisch voor bacterie
- 1 insert
- Attachment sites
- Integrase (Int), integration hostfactor (IHF), excisionase (Xis)
Bv: DONR,DEST, ENTR
Bij gateway blijft e altijd een attL/att3 achter in je expressieconstruct
, Basic expressievector
ORI: Startpunt replicatie
Promotor: startpunt transcriptie
Insertgen: Doelgen dat je wilt kloneren
MCS: Bevat 5’ en 3’ sites waarin RE knippen
Selectiemerker: bv resistentie tegen AB waardoor enkel bacteriën die plasmide dragen overleven op het selectief
medium
5’ UTR en 3’ UTR
Terminale transferase 1) Insert & vector geknipt
2) Terminal transferase (voegt homopolymeerstaarten) + dCTP (voor vector) + dGTP (insert)
https://youtu.be/S2G2-bVTWzI 3) Klenow DNA polymerase herstelt DNA gap (ontstaan door tails lengte verschil)
4) DNA ligase herstel discontinuïteiten (nicks)
(klassiek DNA polymerase heeft wel 5’ exonuclease activiteit)
Klenow DNA pol heeft wel 3’ exonuclease activiteit -> proofreading activiteit behouden)
Let op: doet geen knipwerk
Basic PCR
ExoSAP-IT = DNA-zuiveringsreagens dat na PCR wordt gebruikt
Cloneringstechnieken
Type Werking
Traditional / conventionele 1) Knip gene of interest met RE
cloning 2) Plasmide knippen met dezelfde RE in MCS
3) Voeg beide samen + T4 DNA ligase (3’OH -5’P)
https://youtu.be/b9Lm2TUDN2M 4) Transformatie: hitte shock d.m.v. CaCl2, electroporatie,…
5) Selectie
- 1 insert
T-A cloning 1) Taq DNA polymerase voegt een A-overhangen aan PCR-product
2) Vector bevat T-overhang
3) Meng PCR-product + vector + T4 DNA ligase (wel ATP) of bij TOPO T-A cloning: Topoisomerase
ligase (geen ATP)
4) Transformatie
5) Meestal blauw/wit screening (lacZ α in MCS) voor onderscheiding inserts
- 1 insert
- bv: TOPO-vector
,Golden gate assembly cloning D.m.v. adaptors Dmv linkers
Ontwerp insert Ontwerp insert
https://youtu.be/EpHeu44hitI 1) Voeg adaptor (blunt – sticky) + T4 DNA ligase (ATP) 1) Voeg linker (blunt – blunt) + T4 DNA ligase (ATP)
2) Voeg polynucleotide kinase (ATP) 2) Voeg 2S RE
(niet zo belangrijk)
Maak plasmide ready Ontwerp plasmide
1) Knipt plasmide met 2S RE (halen een stuk er uit) 1) Knip plasmide met 2S RE (halen een stuk er uit)
Voeg insert en plasmide bijeen Voeg insert en plasmide bijeen
Alkalische fosfatase belet recirculatie zonder insertie vreemd DNA door verwijdering 5’P-groepen van vectoren
zonder insert
Niet-geligeerde fragmenten verwijderd door digestie bv. PlasmidSafe exonuclease
- Meerdere inserts tegelijk
IVA (in vivo assembly) Cloning 1) Ontwerp primers met 20nt homologe overhang (tailed primer)
2) PCR-amplificatie
Geen: RE, infusion enzyme 3) DpnI digestie: Verwijder gemethyleerd DNA-template
In vivo 4) Transformatie in competente bacteriën
5) Bacteriën herstellen zelf door homologe recombinatie
Single tube universele cloning system
- 1 insert tegelijk
RE vrije kloneringstechnieken
Gibson Assembly Cloning Ervoor: vector lineariseren (wel door RE) + PCR amplificatie
1) T5 Exonuclease verwijdert 5’ uiteinden van insert-> 15bp ss overhang
Wel: Ligase, DNA pol, exon = chew-back
Geen: Fosfatase, RE 2) DNA-polymerase verlengt stuk
3) DNA ligase ligeert insert en vector
https://youtu.be/etPiygqEv5E - Meerdere inserts tegelijk
RS1 RS2 ENZO HIERBIJ????????? RS1/RS2 horen bij het lineariseren van de
vector door restrictie-enzymen.
2 PCR stappen
,In fusion cloning 1) Ontwerp primers met 15bp complementariteit aan vector (dmv PCR)
2) PCR-amplificatie van fragmenten en vector (vector moet eerst lineair gemaakt worden)
Wel: In-Fusion kit 3) In-Fusion enzymmix -> verwijdert nucleotiden aan 5’
Geen: Geen RE, externe 3) Transformeer in E.Coli
ligase/polymerase, ligase
Voordelen:
Gelijkaardig aan Gibson, - In vitro
verschil: geen ligase & meestal - Slechts 15 bp overlap ipv 25
1 insert - Sneller
- 1 insert (kan meerdere, maar is minder stabiel dan in Gibson)
https://youtu.be/eBvZ7UlmyLU?list=
PLSxmk78eQiuCAT1SdhiLJmdBZCtEWTdXH
Gateway cloning = site-specifieke recombinatie-techniek gebaseerd op het λ-fage-systeem (lysogene situatie)
Overzicht: donor vector -> entry vector -> bestemmingsvector
Geen: RE, ligase
Stap 1: BP clonase: Insert in Entry Clone
https://youtu.be/e_ShyrRrufM
https://youtu.be/q3y4Xp_xuik Enzymen: Int + IHF
attB + attP → attL + attR
Stap 2: LR Clonase: Insert van Entry Clone naar Destination Vector
Enzymen: Int + IHF + Xis
attL + attR → attB + attP
ccdA: bevat anitoxine
ccdB: bevat toxine: suicide gene: toxisch voor bacterie
- 1 insert
- Attachment sites
- Integrase (Int), integration hostfactor (IHF), excisionase (Xis)
Bv: DONR,DEST, ENTR
Bij gateway blijft e altijd een attL/att3 achter in je expressieconstruct
, Basic expressievector
ORI: Startpunt replicatie
Promotor: startpunt transcriptie
Insertgen: Doelgen dat je wilt kloneren
MCS: Bevat 5’ en 3’ sites waarin RE knippen
Selectiemerker: bv resistentie tegen AB waardoor enkel bacteriën die plasmide dragen overleven op het selectief
medium
5’ UTR en 3’ UTR
Terminale transferase 1) Insert & vector geknipt
2) Terminal transferase (voegt homopolymeerstaarten) + dCTP (voor vector) + dGTP (insert)
https://youtu.be/S2G2-bVTWzI 3) Klenow DNA polymerase herstelt DNA gap (ontstaan door tails lengte verschil)
4) DNA ligase herstel discontinuïteiten (nicks)
(klassiek DNA polymerase heeft wel 5’ exonuclease activiteit)
Klenow DNA pol heeft wel 3’ exonuclease activiteit -> proofreading activiteit behouden)
Let op: doet geen knipwerk
Basic PCR
ExoSAP-IT = DNA-zuiveringsreagens dat na PCR wordt gebruikt
