1. Definieer de term flowcytometrie
Flowcytometrie is het detecteren en meten van cellen en hun eigenschappen, in een laminaire
vloeistofstroom d.m.v. een toestel genaamd de flowcytometer. Cellen passeren 1 voor 1 langs
een lichtbron (vaak een laser) en de wijze van lichtverstrooiing (forward and side scatter) en
uitgezonden fluorescentie worden opgemeten om het celtype en eventuele afwijkingen te
karakteriseren.
2. Beschrijf welk type biologisch staal het meest geschikt is voor een FCMA
Elke partikel of cel in oplossing met een grootte van 0,2-150 μm is geschikt voor
flowcytometrische analyse. Elke staal kan dus geschikt worden gemaakt voor FCMA door ze in
single cell suspensie te brengen; cellen scheiden van elkaar kan mechanisch of enzymatisch
(trypsine), en nadien moeten ze in suspensie worden gebracht. Doordat in de FCM cellen 1 per 1
langs de lichtbron passeren kunnen ook heterogene stalen worden geanalyseerd d.m.v. de FCM.
3. Beschrijf welke kenmerken van een cel of partikel door een flowcytometer
kunnen gemeten worden (= optische vingerafdruk)
De flowcytometer meet informatie op m.b.t.:
❥ De relatieve grootte
❥ De relatieve granulariteit en interne complexiteit
❥ De relatieve fluorescentie intensiteit
Uit deze 3 parameters kunnen dan conclusies worden getrokken over met welke cellen we te
maken hebben en al dan niet mogelijke afwijkingen die ze vertonen.
1|Pagina
, 4. Identificeer de 3 componenten (= hoofdonderdelen) van een flowcytometer
(fluidica, optica en electronica) en beschrijf hun respectievelijke functies
Fluidica: zorgt voor het transport van cellen en dat de cellen 1 voor 1 langs de laser passeren.
Cellen worden uit de sample tube gezogen en in
de cuvet geplaatst, aan deze cellen wordt
geleidingsvloeistof toegevoegd die de cellen zal
geleiden doorheen de flow chamber, en door het
hydrodynamisch focusseren zullen de cellen
mooi op een rijtje langs de laser zullen passeren.
Dit gebeurt door een sheath flow; een
vloeistofstroom, bestaande uit een buffer zoals
PBS, zal de vloeistofstroom met cellen geheel
omringen. De sheath flow heeft een hogere
snelheid, waardoor de vloeistofstroom met
cellen gefocust wordt. Hierdoor worden de cellen
gedwongen één voor één de flow chamber binnen
te gaan. Voor hydrodynamisch focusseren moet
echter een laminaire stroom zijn. Ook voor het
sorteren na het opmeten van de data zal de
fluidica zorgen.
Optica: zal instaan voor de eigenlijke meting uit te voeren door enerzijds lichtverstrooiing en
anderzijds opmeten van fluorescentie
De cellen gaan doorheen de flow chamber en
passeren een lichtbron, deze is vaak een
monochromatische laser. Deze wordt benut voor 4
redenen; als eerste heeft hij een hoge lichtenergie,
zo kan je alle cellen exciteren tot het uitzenden van
fluorescentie, ten tweede is een laser optimaal
voor focussering omdat hij precies, energie op 1
oppervlak aanstraalt en tot slot omdat hij constant
is, de laser is monochromatisch en heeft dus altijd
een constante en specifieke golflengte en de
golflengte van de uittredende lichtbundel kan
worden gecontroleerd m.b.v. een prisma of filter.
Naast de lichtbron hebben we ook detectoren die de uitgezonden lichtsignalen gaan capteren
Zowel lichtverstrooiing als uitgezonden fluorescentie worden opgemeten door de verschillende
detectoren.
Naast de lichtbron en detectoren zijn er ook dichroïsche spiegels; deze geleiden de lichtstralen
naar de correcte detectoren. Een detector voor rood licht moet dus enkel golflengten voor rood
licht krijgen. Dit doen ze door de lichtbundel te splitsen op basis van golflengte en te sturen in
een bepaalde richting (bv. 90°).
2|Pagina
Flowcytometrie is het detecteren en meten van cellen en hun eigenschappen, in een laminaire
vloeistofstroom d.m.v. een toestel genaamd de flowcytometer. Cellen passeren 1 voor 1 langs
een lichtbron (vaak een laser) en de wijze van lichtverstrooiing (forward and side scatter) en
uitgezonden fluorescentie worden opgemeten om het celtype en eventuele afwijkingen te
karakteriseren.
2. Beschrijf welk type biologisch staal het meest geschikt is voor een FCMA
Elke partikel of cel in oplossing met een grootte van 0,2-150 μm is geschikt voor
flowcytometrische analyse. Elke staal kan dus geschikt worden gemaakt voor FCMA door ze in
single cell suspensie te brengen; cellen scheiden van elkaar kan mechanisch of enzymatisch
(trypsine), en nadien moeten ze in suspensie worden gebracht. Doordat in de FCM cellen 1 per 1
langs de lichtbron passeren kunnen ook heterogene stalen worden geanalyseerd d.m.v. de FCM.
3. Beschrijf welke kenmerken van een cel of partikel door een flowcytometer
kunnen gemeten worden (= optische vingerafdruk)
De flowcytometer meet informatie op m.b.t.:
❥ De relatieve grootte
❥ De relatieve granulariteit en interne complexiteit
❥ De relatieve fluorescentie intensiteit
Uit deze 3 parameters kunnen dan conclusies worden getrokken over met welke cellen we te
maken hebben en al dan niet mogelijke afwijkingen die ze vertonen.
1|Pagina
, 4. Identificeer de 3 componenten (= hoofdonderdelen) van een flowcytometer
(fluidica, optica en electronica) en beschrijf hun respectievelijke functies
Fluidica: zorgt voor het transport van cellen en dat de cellen 1 voor 1 langs de laser passeren.
Cellen worden uit de sample tube gezogen en in
de cuvet geplaatst, aan deze cellen wordt
geleidingsvloeistof toegevoegd die de cellen zal
geleiden doorheen de flow chamber, en door het
hydrodynamisch focusseren zullen de cellen
mooi op een rijtje langs de laser zullen passeren.
Dit gebeurt door een sheath flow; een
vloeistofstroom, bestaande uit een buffer zoals
PBS, zal de vloeistofstroom met cellen geheel
omringen. De sheath flow heeft een hogere
snelheid, waardoor de vloeistofstroom met
cellen gefocust wordt. Hierdoor worden de cellen
gedwongen één voor één de flow chamber binnen
te gaan. Voor hydrodynamisch focusseren moet
echter een laminaire stroom zijn. Ook voor het
sorteren na het opmeten van de data zal de
fluidica zorgen.
Optica: zal instaan voor de eigenlijke meting uit te voeren door enerzijds lichtverstrooiing en
anderzijds opmeten van fluorescentie
De cellen gaan doorheen de flow chamber en
passeren een lichtbron, deze is vaak een
monochromatische laser. Deze wordt benut voor 4
redenen; als eerste heeft hij een hoge lichtenergie,
zo kan je alle cellen exciteren tot het uitzenden van
fluorescentie, ten tweede is een laser optimaal
voor focussering omdat hij precies, energie op 1
oppervlak aanstraalt en tot slot omdat hij constant
is, de laser is monochromatisch en heeft dus altijd
een constante en specifieke golflengte en de
golflengte van de uittredende lichtbundel kan
worden gecontroleerd m.b.v. een prisma of filter.
Naast de lichtbron hebben we ook detectoren die de uitgezonden lichtsignalen gaan capteren
Zowel lichtverstrooiing als uitgezonden fluorescentie worden opgemeten door de verschillende
detectoren.
Naast de lichtbron en detectoren zijn er ook dichroïsche spiegels; deze geleiden de lichtstralen
naar de correcte detectoren. Een detector voor rood licht moet dus enkel golflengten voor rood
licht krijgen. Dit doen ze door de lichtbundel te splitsen op basis van golflengte en te sturen in
een bepaalde richting (bv. 90°).
2|Pagina
