Formularium
Enkelvoudige verdunning
Aantal ml nodig uit stock:
benodigde eindmassa (g) benodigde eindmassa (cellen)
g = mL nodig uit stock = mL nodig uit stock
conc. stock (mL) cellen
conc. cellen in stock ( mL )
Zie voorbeeld 1 Zie voorbeeld 2
Voorbeeld 1
Een oplossing van 5 ml met concentratie 1 mg/ml eiwit moet verdund worden tot een oplossing van 5 ml
met concentratie 50 µg/ml.
- 5 ml nodig met 50 µg/ml ⤑ in totaal heb je 250 µg of 0,25 mg eiwit nodig
0,25 mg
mg = 0,25 ml nodig uit stock
1 mL
- Neem 0,25 ml uit de stockoplossing en leng aan met diluent tot 5 ml
Voorbeeld 2
Een celsuspensie bevat 2 x 106 cellen/ml. Hoeveel van de suspensie heb je nodig om een 96well plaat te
vullen met 30 000 cellen/well als je weet dat het eindvolume van iedere well 200 µl is.
- 96 wells nodig met 30 000 cellen/well ⤑ in totaal heb je 2 880 000 cellen nodig
2 880 000 cellen
= 1,44 mL nodig van startsuspensie
cellen
2 ∙ 106 mL
- Neem 1,44 ml uit startsuspensie en leng aan met groeimedium om een totaal volume van 19,2 ml
(200µl x 96 wells) te bekomen
KOVA telkamer
cellen
# = gemiddeld # cellen per klein rooster × 90 000 x verdunningsfactor
mL
Voorbeeld
- 1/10 verdunning van cerebrospinale vloeistof
- 50 RBC geteld in 10 kleine vierkantjes
50 RBC
RBC/ml = x 90 000 x 10 = 4 500 000 RBC/ml in originele celsuspensie
10 vierkantjes
Viabiliteit
levende cellen
Viabiliteit (%) = × 100%
totaal aantal cellen
1|Pagina
, Experiment 1: immunochemie
Wat doen we?
D.m.v. een ELISA gaan we trachten te bepalen wat de concentratie is van 2 onbekende antigenen.
Wij gaan gebruik maken van een competitief, direct, heterogeen systeem. De antigenen zullen in competitie
gaan met andere ongelabeld antigenen, de antigenen binden rechtstreeks met de antilichamen en we
hebben een mengsel van antigenen en proteïnen.
Principe:
1. We voegen een overmaat biotine aan ons antigeenoplossing zodanig dat ALLE antigenen een biotine
gebonden zullen hebben, het residueel biotine eruit krijgen d.m.v. een ontzoutingskolom
2. D.m.v. bradford reagens en BSA gaan we bepalen in welke fractie en wat de concentratie is van ons
biotine-gelabeld antigen
3. Op antilichamen, welke gebonden zitten op het oppervlak, voegen we enerzijds ongelabeld en
anderzijds onze onbekende antigenen, en aan al deze voegen we nog onze biotine-gelabelde antigenen
4. Beide gaan in competitie om effectief te binden op het antilichaam
5. Nadien voegen we het ABC-complex toe welke zal binden aan het antigen-biotine complex
6. Het ABC-complex bevat een enzym, nl HRP, welke het substraat gaat omzetten in een gekleurd
reactieproduct
7. We meten de golflengte en intensiteit v/d kleur en zetten deze uit tegenover de conc. in een curve
Zwak kleursignaal = meer ongekend antigen + minder biotine-gelabeld antigen (en vice versa!)
Ontzoutingskolom
❥ Scheiding o.b.v. grootte
❥ Biotine is klein en gaat trager door de grote
Sephadexkorrels omdat het laatste poriën bevat waarin
het biotine in kan gaan
❥ Biotine-gelabeld antigen gaat wel snel erdoorheen
omdat het groot is en dus niet doorheen die kleine
poriën gaat
❥ Echter is ons biotine-gelabeld antigen kleurloos, we
weten dus niet wanneer hij effectief doorheen de
kolom is geraakt
❥ We gaan kalibreren met blue-Dextran 2000, een lange
suikerketen met een blauwe kleur en dezelfde grootte
als het biotine-gelabeld antigen, we gaan nu dus zien
wanneer dat het BD-2000 passeert en zo weten we
dan ook wanneer ons biotine-gelabeld antigen
gepasseerd is.
2|Pagina
Enkelvoudige verdunning
Aantal ml nodig uit stock:
benodigde eindmassa (g) benodigde eindmassa (cellen)
g = mL nodig uit stock = mL nodig uit stock
conc. stock (mL) cellen
conc. cellen in stock ( mL )
Zie voorbeeld 1 Zie voorbeeld 2
Voorbeeld 1
Een oplossing van 5 ml met concentratie 1 mg/ml eiwit moet verdund worden tot een oplossing van 5 ml
met concentratie 50 µg/ml.
- 5 ml nodig met 50 µg/ml ⤑ in totaal heb je 250 µg of 0,25 mg eiwit nodig
0,25 mg
mg = 0,25 ml nodig uit stock
1 mL
- Neem 0,25 ml uit de stockoplossing en leng aan met diluent tot 5 ml
Voorbeeld 2
Een celsuspensie bevat 2 x 106 cellen/ml. Hoeveel van de suspensie heb je nodig om een 96well plaat te
vullen met 30 000 cellen/well als je weet dat het eindvolume van iedere well 200 µl is.
- 96 wells nodig met 30 000 cellen/well ⤑ in totaal heb je 2 880 000 cellen nodig
2 880 000 cellen
= 1,44 mL nodig van startsuspensie
cellen
2 ∙ 106 mL
- Neem 1,44 ml uit startsuspensie en leng aan met groeimedium om een totaal volume van 19,2 ml
(200µl x 96 wells) te bekomen
KOVA telkamer
cellen
# = gemiddeld # cellen per klein rooster × 90 000 x verdunningsfactor
mL
Voorbeeld
- 1/10 verdunning van cerebrospinale vloeistof
- 50 RBC geteld in 10 kleine vierkantjes
50 RBC
RBC/ml = x 90 000 x 10 = 4 500 000 RBC/ml in originele celsuspensie
10 vierkantjes
Viabiliteit
levende cellen
Viabiliteit (%) = × 100%
totaal aantal cellen
1|Pagina
, Experiment 1: immunochemie
Wat doen we?
D.m.v. een ELISA gaan we trachten te bepalen wat de concentratie is van 2 onbekende antigenen.
Wij gaan gebruik maken van een competitief, direct, heterogeen systeem. De antigenen zullen in competitie
gaan met andere ongelabeld antigenen, de antigenen binden rechtstreeks met de antilichamen en we
hebben een mengsel van antigenen en proteïnen.
Principe:
1. We voegen een overmaat biotine aan ons antigeenoplossing zodanig dat ALLE antigenen een biotine
gebonden zullen hebben, het residueel biotine eruit krijgen d.m.v. een ontzoutingskolom
2. D.m.v. bradford reagens en BSA gaan we bepalen in welke fractie en wat de concentratie is van ons
biotine-gelabeld antigen
3. Op antilichamen, welke gebonden zitten op het oppervlak, voegen we enerzijds ongelabeld en
anderzijds onze onbekende antigenen, en aan al deze voegen we nog onze biotine-gelabelde antigenen
4. Beide gaan in competitie om effectief te binden op het antilichaam
5. Nadien voegen we het ABC-complex toe welke zal binden aan het antigen-biotine complex
6. Het ABC-complex bevat een enzym, nl HRP, welke het substraat gaat omzetten in een gekleurd
reactieproduct
7. We meten de golflengte en intensiteit v/d kleur en zetten deze uit tegenover de conc. in een curve
Zwak kleursignaal = meer ongekend antigen + minder biotine-gelabeld antigen (en vice versa!)
Ontzoutingskolom
❥ Scheiding o.b.v. grootte
❥ Biotine is klein en gaat trager door de grote
Sephadexkorrels omdat het laatste poriën bevat waarin
het biotine in kan gaan
❥ Biotine-gelabeld antigen gaat wel snel erdoorheen
omdat het groot is en dus niet doorheen die kleine
poriën gaat
❥ Echter is ons biotine-gelabeld antigen kleurloos, we
weten dus niet wanneer hij effectief doorheen de
kolom is geraakt
❥ We gaan kalibreren met blue-Dextran 2000, een lange
suikerketen met een blauwe kleur en dezelfde grootte
als het biotine-gelabeld antigen, we gaan nu dus zien
wanneer dat het BD-2000 passeert en zo weten we
dan ook wanneer ons biotine-gelabeld antigen
gepasseerd is.
2|Pagina
