Samenvatting H17 biochemie (behaalde 18/20)

H17: replicatie en DNA
foutenherstel
- Replicatie gebeurt in specifieke cellen, niet alle cellen tegelijk
- veel cellen zijn gedifferentieerd: hebben een specifieke functie
o Bv. Zenuwcel (motorneuron) ziet er totaal verschillend uit omdat het een
verschillende functie heeft
o Geslachtscellen
- sommige cellen repliceren wel, gaan delen, DNA wordt niet verdubbelt (twee identieke
dochtercellen): mitose
- volledig gedifferentieerde cel gaan niet meer delen, de stamcellen wel
o stamcel kan delen tot ander stamcel die kan weer gaan delen OF kan gaan
differentiëren

1. DNA replicatie
Overzicht cyclus
- Celcyclus = M-fase + interfase
o Interfase = G1 + S + G2 fasen
 G1: toename V, is GEEN rustfase
 S: DNA synthese (transcriptie)
o M-fase= mitose + cytokinese
 Cytokinese: celdeling dochtercellen


DNA synthese tijdens de S-fase
- Generatietijd: 18-24h voor sneldelende cellen in cultuur
o M-fase = mitose + cytokinese (30-45 min in snel-delende cellen)
Mitotische index = 3-5% voor cellen in cultuur.
o S-fase: replicatie (6-8h), gebruik van 3H-deoxythymidine voor meten van lengte van
S-fase
 3H-deoxythymidine= geladen tritium (radio-isotoop) detecteren met
lichtgevoelige film: aanwezigheid 3H-deoxythymidine: nog in S fase
o G1 (variabele duur)
o G2

Mogelijke mechanismen van replicatie
1. Semiconservatie replicatie
- Parentale duplex2 duplexen met 1 parentale en 1 nieuwe streng
2. Conservatieve replicatie
- Parentale duplex 1 parentale duplex en 1 nieuwe duplex
3. Dispersieve replicatie
- Parentale duplex 2 duplexen met afwisselend parentale en nieuwe delen in de streng

,  Is de replicatie conservatief of semi-conservatief?
- Meselson & Stahl: groei bacteriën, eerst in 15N, dan 14N medium
- Scheiding zwaar en licht DNA via densiteits-gradiënt-centrifugatie
Experiment:
1. Bacteriën, opgegroeid in N15 (zwaarder, stabiel isotoop)DNA gelabeld met N15
2. worden in N14 medium gestoken  nieuw DNA met N14
3. DNA scheiden via densiteits-gradiënt-centrifugatie mbv cesium chloride
- lichtere (N14) partikels liggen hoger
- zwaardere (N15) partikels liggen lager
- hybride (N14 en N15) partikels liggen middenin

4. Na 1e replicatie: 1 band gemiddelde dichtheid (hybride)
- Conservatieve replicatie: zouden twee banden krijgen 1 duplex was
N15-N15, andere N14-N14
 NIET VIA CONSERVATIEVE REPLICATIE
- Dispersieve replicatie: zou 1 band krijgen van gemiddelde dichtheid
- Semi-conservatieve replicatie: 1 band krijgen van gemiddelde
dichtheid

5. Na 2e replicatie: 2 banden gemiddelde en lichte dichtheid
- Dispersieve replicatie: 1 band van gemiddelde dichtheid
- Semi-conservatieve replicatie: 1 band gemiddelde en 1 band lichte dichtheid
 VIA SEMI_CONSERVATIEVE REPLICATIE

Hoeveel en welke banden zie je in de densiteitsgradiënt als je de bacterïen die opgegroeid zijn in N15
verder laat groeien voor 3 generaties in aanwezigheid van N14?
2 banden : 1 hybride en 1 lichte

De DNA replicatie is semi-conservatief
DNA wordt geïsoleerd en onderworpen aan 3H-thymidine (radioactief tritium)
- DNA replicatie 1: beiden chromatiden gelabeld
- DNA replicatie 2: 1 chromatiden gelabeld, andere niet
 Sem-conservatieve replicatie

, De replicatie
bij bacteria
- Replicatie in aanwezigheid van 3H-thymidine; detecteerbaar via autoradiografie
- Theta-replicatie begint in AT-rijke regio (‘Origin of replication’, OriC) en verloopt
bidirectioneel via twee replicatievorken; vormt intermediaire theta () structuur
- Replicatie gekoppeld aan splitsing door topoisomerase




bij




eukaryoten
- Ca. 20.000 ORIs (in gist: ARS, Autonomously Replicating Sequence )
• Meer dan in bacteria
- Replicons (replicatie-eenheden):
• replicatie-bubbels: fuseren als ze elkaar tegenkomen
• twee replicatievorken (bidirectioneel)