WPO 2
I. inleiding
histologie bestudeert samenstelling weefsels: nadruk v celtypen in weefsel = m.b.v. microscoop bekeken
celtypen = verschillen door vorm + zichtbare eigenschappen + functies
wnr cellen groeperen = weefsel
weefsel = geordende groep cellen met gelijkaardige eigenschappen verkregen door celdifferentiatie
II. correct gebruik van lichtmicroscoop
beste = om “Köhler-belichting” toe te passen
1. lichtschakelaar aanzetten (lichtsterkte)
2. preparaat in houder plaatsen (onder object)
3. lokaliseren weefsel (kleinste vergroting)
4. scherpstellen
5. velddiafragma bijna dichtdraaien
6. condensor + focus scherpstellen (beeld oculair scherp)
7. diafragmalichtvlek centreren
8. velddiafragma opendraaien tot hele veld juist belicht
9. apertuurdiafragma regelen (contrast)
10. overgaan naar hogere vergroting: herhaal stap 4-9
immersie-objectief (100x) enkel gebruiken na druppeltje immersie-olie op preparaat
II.1 het maken van tekeningen
• celgrenzen
• grootteverhoudingen ltl v celtypen
• verhouding kern/cytoplasma
• teken groepje cellen in weefselverband
• getekende vergroting
• 1cel = 2cm
III. vervaardigen van preparaten
III.1 het vervaardigen van weefselcoupes
wrm preparaten ? biologisch materiaal = weinig lichtdoorlatend + geeft weinig contrast
doel ? cellen + weefsel observeerbaar maken voor LM/EM
methode ?
1) fixeren van weefsel: zodat geen morfologische wijzigingen
doel? weefsel vastleggen in vivo toestand (=oorspronkelijke structuur) zonder artefacten optreden +
beschermen weefsel tegen autolyse, anoxie en microbiële aantasting (=3 oorzaken artefacten)
! wnr weefsel bewerkt kunnen artificiële structuren optreden ≠ overeenkomen reële situatie levende cellen!
• via chemische stoffen (=fixatieven): tijdens fixatie treedt denaturatie of ‘cross-linking’ op van
eiwitten in weefsel => werking eiwitten stilgelegd + werking enzymen (=verantwoordelijk uiteenvallen
cellen en weefsels bij isolatie uit lichaam/ na dood =>3 chemicaliën: formaldehyde + glutaaraldehyde +
osmiumtetroxyde MAAR voor paraffinepreparaten = Bouin’s fixatief: mengsel picrinezuur + formaldehyde
—>immersiefixatie: fixatie van buiten uit waarbij weefsel na isolatie uit lichaam in fixatief
ondergedompeld
—>perfusiefixatie: fixatie van binnen uit = enkel mogelijk bij proefdieren => lichaam dier
geperfuseerd + bloed EERST vervangen door NaCl DAN door fixatief (=paraformaldehyde)
• via fysische methode: weefsel gefixeerd door vriezen vloeibare stikstof: snelle diagnose pathologie nodig
, 2) inbedden: weefsel ingebed in materie hard genoeg om coupes maken => paraffine OF plastics
methacrylaat EN epon(= vooral bij EM) => HOE harder inbedmedium, HOE dunner coupes
EERST water uit weefsel verwijderen => coupes onderdompelen baden met stijgende alcoholconcentratie
= dehydratatie
DAN alcohol vervangen door oplosmiddel waarin inbedmiddel oplosbaar is => penetratie inbedmiddel
volgende fase vereenvoudigen
LAATSTE weefsel in vloeibaar inbedmiddel gelegd (vb; warme paraffine) waarna laat hard worden
! inbedmiddel MOET weefsel volledig binnendringen om goede coupes te maken ANDERS slecht zichtbaar !
3) snijden: preparaat voldoende dun om licht door te laten => coupes snijden van weefsel OF orgaan
coupes LM = 3-12 um MAAR coupes TEM = 50-100 nm
v soorten coupes: vries-, paraffine- of epon-coupes
=> dwars of overlangs snijden
• vriespreparaten: + snel proces - morfologie gaat snel kapot
1)weefsel snel vriezen in vloeibare stikstof
2)coupes gesneden m.b.v. vriesmicrotoom
3)coupes gedroogd
4)opnieuw gefixeerd (immersie organische solventer)
5)coupes kleuren (kleurstoffen/ antilichamen)
• paraffine-/ eponcoupes: + behouden langer - trager proces
als coupes ≠ rehydrateert: kleuring ≠ diep genoeg
III.2 het verwerken van celsuspensies
suspensies van losse cellen = op microscoopglaasjes gebracht d.m.v. v technieken
• uitstrijkje = gemaakt door druppeltje suspensie met voorwerpglas over 2de glaasje uitstrijken zodat
dunne film vormt + film aan lucht gedroogd + gefixeerd
• cytospinpreparaat = gemaakt door in speciaal uitgeruste tafelcentrifuge cellen te sedimenteren op
voorwerpglaasje
• celpellet = centrifugeren van celsuspensie tot vast propje cellen
IV. toepassingen van de (licht)microscoop
IV.1 histologie
= weefsels bestudeerd: zowel normale weefsels als pathologische weefsels
weefsels = kleurloos =>v kleuringen toegepast om weefsels + cellen te contrasteren
1) geïsoleerde leverparenchymcellen, rat, toluidineblauw (epon)
behandeling met enzymen (collagenase) => lever herleid tot suspensie losse cellen
bloedvat = omringd door membranen MAAR sinusoïd niet, WEL gemaakt door omringende hepatocyten
bij grote vergroting onderscheiden we ronde kern met 1/2 nucleoli + cytoplasma met donkergekleurde
“eilandjes” van organellen
I. inleiding
histologie bestudeert samenstelling weefsels: nadruk v celtypen in weefsel = m.b.v. microscoop bekeken
celtypen = verschillen door vorm + zichtbare eigenschappen + functies
wnr cellen groeperen = weefsel
weefsel = geordende groep cellen met gelijkaardige eigenschappen verkregen door celdifferentiatie
II. correct gebruik van lichtmicroscoop
beste = om “Köhler-belichting” toe te passen
1. lichtschakelaar aanzetten (lichtsterkte)
2. preparaat in houder plaatsen (onder object)
3. lokaliseren weefsel (kleinste vergroting)
4. scherpstellen
5. velddiafragma bijna dichtdraaien
6. condensor + focus scherpstellen (beeld oculair scherp)
7. diafragmalichtvlek centreren
8. velddiafragma opendraaien tot hele veld juist belicht
9. apertuurdiafragma regelen (contrast)
10. overgaan naar hogere vergroting: herhaal stap 4-9
immersie-objectief (100x) enkel gebruiken na druppeltje immersie-olie op preparaat
II.1 het maken van tekeningen
• celgrenzen
• grootteverhoudingen ltl v celtypen
• verhouding kern/cytoplasma
• teken groepje cellen in weefselverband
• getekende vergroting
• 1cel = 2cm
III. vervaardigen van preparaten
III.1 het vervaardigen van weefselcoupes
wrm preparaten ? biologisch materiaal = weinig lichtdoorlatend + geeft weinig contrast
doel ? cellen + weefsel observeerbaar maken voor LM/EM
methode ?
1) fixeren van weefsel: zodat geen morfologische wijzigingen
doel? weefsel vastleggen in vivo toestand (=oorspronkelijke structuur) zonder artefacten optreden +
beschermen weefsel tegen autolyse, anoxie en microbiële aantasting (=3 oorzaken artefacten)
! wnr weefsel bewerkt kunnen artificiële structuren optreden ≠ overeenkomen reële situatie levende cellen!
• via chemische stoffen (=fixatieven): tijdens fixatie treedt denaturatie of ‘cross-linking’ op van
eiwitten in weefsel => werking eiwitten stilgelegd + werking enzymen (=verantwoordelijk uiteenvallen
cellen en weefsels bij isolatie uit lichaam/ na dood =>3 chemicaliën: formaldehyde + glutaaraldehyde +
osmiumtetroxyde MAAR voor paraffinepreparaten = Bouin’s fixatief: mengsel picrinezuur + formaldehyde
—>immersiefixatie: fixatie van buiten uit waarbij weefsel na isolatie uit lichaam in fixatief
ondergedompeld
—>perfusiefixatie: fixatie van binnen uit = enkel mogelijk bij proefdieren => lichaam dier
geperfuseerd + bloed EERST vervangen door NaCl DAN door fixatief (=paraformaldehyde)
• via fysische methode: weefsel gefixeerd door vriezen vloeibare stikstof: snelle diagnose pathologie nodig
, 2) inbedden: weefsel ingebed in materie hard genoeg om coupes maken => paraffine OF plastics
methacrylaat EN epon(= vooral bij EM) => HOE harder inbedmedium, HOE dunner coupes
EERST water uit weefsel verwijderen => coupes onderdompelen baden met stijgende alcoholconcentratie
= dehydratatie
DAN alcohol vervangen door oplosmiddel waarin inbedmiddel oplosbaar is => penetratie inbedmiddel
volgende fase vereenvoudigen
LAATSTE weefsel in vloeibaar inbedmiddel gelegd (vb; warme paraffine) waarna laat hard worden
! inbedmiddel MOET weefsel volledig binnendringen om goede coupes te maken ANDERS slecht zichtbaar !
3) snijden: preparaat voldoende dun om licht door te laten => coupes snijden van weefsel OF orgaan
coupes LM = 3-12 um MAAR coupes TEM = 50-100 nm
v soorten coupes: vries-, paraffine- of epon-coupes
=> dwars of overlangs snijden
• vriespreparaten: + snel proces - morfologie gaat snel kapot
1)weefsel snel vriezen in vloeibare stikstof
2)coupes gesneden m.b.v. vriesmicrotoom
3)coupes gedroogd
4)opnieuw gefixeerd (immersie organische solventer)
5)coupes kleuren (kleurstoffen/ antilichamen)
• paraffine-/ eponcoupes: + behouden langer - trager proces
als coupes ≠ rehydrateert: kleuring ≠ diep genoeg
III.2 het verwerken van celsuspensies
suspensies van losse cellen = op microscoopglaasjes gebracht d.m.v. v technieken
• uitstrijkje = gemaakt door druppeltje suspensie met voorwerpglas over 2de glaasje uitstrijken zodat
dunne film vormt + film aan lucht gedroogd + gefixeerd
• cytospinpreparaat = gemaakt door in speciaal uitgeruste tafelcentrifuge cellen te sedimenteren op
voorwerpglaasje
• celpellet = centrifugeren van celsuspensie tot vast propje cellen
IV. toepassingen van de (licht)microscoop
IV.1 histologie
= weefsels bestudeerd: zowel normale weefsels als pathologische weefsels
weefsels = kleurloos =>v kleuringen toegepast om weefsels + cellen te contrasteren
1) geïsoleerde leverparenchymcellen, rat, toluidineblauw (epon)
behandeling met enzymen (collagenase) => lever herleid tot suspensie losse cellen
bloedvat = omringd door membranen MAAR sinusoïd niet, WEL gemaakt door omringende hepatocyten
bij grote vergroting onderscheiden we ronde kern met 1/2 nucleoli + cytoplasma met donkergekleurde
“eilandjes” van organellen
