HOOFDSTUK 10: GENOOM MANIPULATIE
Introductie:
Genomische manipulatie:
- Vervangen defecte genen
- Creëren defecte genen in cellen voor in vitro modellen
- Eiwit expressie (zie vroeger: gist & zoogdiercellen)
- Transgene dieren:
o Eiwit expressie
o Dierenmodellen
Gehumaniseerde dieren: brengen humane variant v eiwit tot expressie
Introductie defect gen om ziekte te bestuderen
Fluorescentie: specifieke cellen laten oplichten
…
- Bij voorkeur sterk gecontroleerd:
o Locatie: neveneffecten als interferentie met andere genen
o Aantal integraties: meerdere integraties vaak nt gewenst,
Te veel expressie v eiwit ook tot nevenwerkingen leiden
- Methoden om genoom op exacte locatie te wijzigen:
o Homologe recombinatie: historisch meest gebruikt
o CRISPR: majeure doorbraak in onderzoek
Homologe recombinatie:
- Natuurlijk proces:
o 2 DNA moleculen met (nagenoeg) zelfde seq. dicht bij elkaar
o Uitwisseling
o Bv. herstel dsDNA breuken of cross-over bij meiose
- Toepassingen:
o Om genen uit te schakelen (knockout)
o Om nieuwe genen in te brengen (knockin)
Knockout:
- Plasmide bevat stukken v gen dat uitgeschakeld moet worden
o In gen: selectiemerker (bv NEOR)
- Indien succesvolle recombinatie:
o Doelwit gen nt meer functioneel
o Genomische resistentie
o Resistentie merker laat toe cellen te selecteren waarbij integratie
plaatsgevonden heeft
- Naast homologe recombinatie: random integratie (zeldzaam)
- Volledige plasmide geïntegreerd
- Negatief selectie gen: cellen met gen sterven (bv. HSV-TK)
o HSV-TK gen + gancyclovir in medium: cellen gaan dood
o Negatief selectie gen wordt enkel opgenomen bij random integratie
- Dubbele selectie: enkel cellen met homologe recombinatie geselecteerd
Introductie:
Genomische manipulatie:
- Vervangen defecte genen
- Creëren defecte genen in cellen voor in vitro modellen
- Eiwit expressie (zie vroeger: gist & zoogdiercellen)
- Transgene dieren:
o Eiwit expressie
o Dierenmodellen
Gehumaniseerde dieren: brengen humane variant v eiwit tot expressie
Introductie defect gen om ziekte te bestuderen
Fluorescentie: specifieke cellen laten oplichten
…
- Bij voorkeur sterk gecontroleerd:
o Locatie: neveneffecten als interferentie met andere genen
o Aantal integraties: meerdere integraties vaak nt gewenst,
Te veel expressie v eiwit ook tot nevenwerkingen leiden
- Methoden om genoom op exacte locatie te wijzigen:
o Homologe recombinatie: historisch meest gebruikt
o CRISPR: majeure doorbraak in onderzoek
Homologe recombinatie:
- Natuurlijk proces:
o 2 DNA moleculen met (nagenoeg) zelfde seq. dicht bij elkaar
o Uitwisseling
o Bv. herstel dsDNA breuken of cross-over bij meiose
- Toepassingen:
o Om genen uit te schakelen (knockout)
o Om nieuwe genen in te brengen (knockin)
Knockout:
- Plasmide bevat stukken v gen dat uitgeschakeld moet worden
o In gen: selectiemerker (bv NEOR)
- Indien succesvolle recombinatie:
o Doelwit gen nt meer functioneel
o Genomische resistentie
o Resistentie merker laat toe cellen te selecteren waarbij integratie
plaatsgevonden heeft
- Naast homologe recombinatie: random integratie (zeldzaam)
- Volledige plasmide geïntegreerd
- Negatief selectie gen: cellen met gen sterven (bv. HSV-TK)
o HSV-TK gen + gancyclovir in medium: cellen gaan dood
o Negatief selectie gen wordt enkel opgenomen bij random integratie
- Dubbele selectie: enkel cellen met homologe recombinatie geselecteerd
