Samenvatting HT 8 DNA analyse- Farmaceutische biotechnologie (K0B04A)

HOOFDSTUK 8: DNA/RNA ANALYSE & NEXT GENERATION SEQUENCING

DNA/RNA analyse:
- Basisonderzoek:
o Bestuderen eiwit DNA-interacties
o Ontrafelen transcriptie/translatie
o Genomische organisatie & veranderingen
o Classificeren virussen, bacteriën, etc
- Gezondheidszorg:
o Genetisch onderzoek (verwantschap, forensisch, genetische aandoeningen, …)
o Opvolging epidemieën
o Diagnostische tests
- Methoden nodig om:
o DNA stalen met elkaar te vergelijken (verschillen/gelijkenissen)
o Code te bepalen (sequentiebepaling)
o DNA/eiwitinteracties te bestuderen: wel/geen binding? Waar?

DNA-eiwit interactie:

Gel mobility shift assay:
- Principe:
o DNA scheiden op agarose gel: scheiden obv grootte, DNA visualiseren
o Techniek doen in aan- en afwezigheid v eiwit waarvan je wil weten of die aan DNA
bindt
o Bij binding: grootte v DNA veranderen + mobiliteit in gel ook

DNAseI foot printing:
- Principe:
o Fragmentjes DNA labellen bv radioactief
o Eiwit toevoegen
o DNAseI toevoegen: indien eiwit gebonden kan die nt knippen hier
enkel want kan nt binden
o Op agarose gel: nt geknipte fragmenten (aanwezigheid eiwit) groter
want herkenningsseq is verborgen voor DNAseI

ChIP-Seq:
- Principe:
o Eiwit binden aan DNA
o Toevoegen paraformaldehyde: verankert covalent eiwit aan DNA
o DNA knippen met bv. DNAseI of restrictie enzymen
o DNA nt geknipt op stuk waar bv eiwit aan gebonden is
o Stukjes DNA met bv op 1 vd stukken eiwit covalent gebonden
o Antilichaam die specifiek bindt aan fragment met eiwit
o Antilichaam neerslaan door bv magnetisch te maken
o Hangen aan magnetische parels + via magneet degene met eiwit gebonden scheiden
v degenen zonder eiwit gebonden
o Mengsel v ons eiwit en DNA waaraan eiwit gebonden is, rest is weggewassen
o Verwijderen v proteïnen door bv toevoegen proteasen: eiwitten wegknippen en
antilichaam ook
o Stukje DNA waaraan eiwit origineel gebonden was

, o Hiervan sequentie bepalen
Bepalen van start/stop van regio’s van interesse in DNA/RNA:
Waarvoor:
- Bepalen waar DNA /RNA fragment begint
- Bepalen welke DNA/RNA sequentie zich voor/na gekende sequentie bevindt

Nuclease S1 mapping:
- Bepalen waar bv. transcriptie begint of wat intron/exon grenzen zijn
- Principe Begin transcriptie (dus begin RNA molecule):
o Ontwerp 5’-gelabelde DNA probe die wrs bindt aan regio v interesse (bv. grens
intron/exon)
 Labeling nodig voor detectie bv radioactief
o Hybridisatie probe en mRNA + toevoegen nuclease S1
o Nuclease S1 knipt enkel ssDNA of ssRNA
 Wat nt gehybridiseerd is, wordt geknipt
o Analyseren overblijvende DNA/RNA met agarose gelelectroforose
o Door lengteverschil geknipte/nt geknipte probe bepalen bindplaats
- Principe Intron/exon grens:
o Probe maken die op mRNA niveau bindt, gedesigned obv intron en exon grens of
vermoedelijke grens,
o Bovenaan bindt die 100% complementair, op mRNA niveau nt meer want
intronen weg hier
o Nuclease S1 toevoegen
o Enkelstrengige delen zijn weg

Primer extensie:
- Bepalen waar bv. transcriptie begint (5’ uiteinde)
- Principe:
o Zuiver mRNA op
o Gelabelde primer die bindt aan mRNA
o Schrijf stukje mRNA over met reverse transcriptase
o Doorgaan tot polymerase geen template meer heeft
o Stukje DNA 100% complementair aan mRNA en dus start v mRNA molecule
zal geïncorporeerd worden in DNA molecule die aangemaakt wordt
o Verwijder RNA (gelelectroforse, RNAse, …)
o Bepaal sequentie vh gesynthetiseerde DNA

Thermal Asymmetric Interlaced (TAIL)-PCR:
- Doel: ongekende regio’s up/down-stream v gekend gen bepalen
- Principe:
o 3 primers die specifiek zijn voor gekende sequentie (SP1, 2 & 3)
o 1 volledig gedegenereerde primer (AD), overal in genoom binden
o 3 opeenvolgende PCR reacties, waarbij amplificatie steeds specifieker
wordt
 PCR 1: SP1 + AD
 PCR 2: SP2 + AD
 PCR 3: SP3 + AD
o Product na PCR 3 wordt opgezuiverd en gesequeneerd
 Bv. methode v sanger