Samenvatting HT 6 over enzymen - Farmaceutische biotechnologie (K0B04A)

HOOFDSTUK 6: ENZYMEN GEBRUIKT BIJ RECOMBINANTE DNA TECHNOLOGIE

Enzymen:
= eiwitten die bepaalde functie uitvoeren of katalytische reactie doen

Restrictie-enzymen:

Restrictie enzymen:
- Enzymen door bacterien gesynthetiseerd om zichzelf te verdedigen
- Kunnen DNA heel specifiek knippen obv bepaalde herkenningsseq
- Toepassing: gebruiken om 2 stukken DNA aan elkaar te plakken
+ Zie HT 2

Ligasen:

Ligasen:
- Lijmen 2 stukken DNA aan elkaar
- Komen voor in alle levende organismen
o DNA synthese (ligatie v Okazaki fragmenten)  zie HT 1
o Herstel DNA bij breuken
- Voorwaarde: ene keten vrije 5’-fosfaat, andere vrije 3’OH groep:
o Hoe:
 Bepaalde stukje DNA in 5’3’ richting + aan 3’uiteinde OH groep en aan 5’
fosfaatgroep aan andere kant
 DNA ligase: aan elkaar ligneren, ATP zorgt voor energie voor
fosfodiesterbinding te maken
 DNA hangt terug covalent aan elkaar
o Energiebronnen:
 T4 DNA ligase: ATP (= ligasen uit fagen)
 E.coli DNA ligase: NAD+
Toepassingen:
- Ligeren v 2 geknipte stukken DNA:
o Principe:
 Na knippen en plakken: sticky ends
 2e streng in buurt brengen met
complementaire basen
 Aan elkaar binden
 Als vrije 5’fosfaat en vrije 3’OH aanwezig zijn: DNA ligase
- Ligeren v adaptoren:
o Synthetische stukken DNA (met gekende seq) ligeren aan bestaand dsDNA
 Nieuwe herkennings-sequenties voor restrictie enzymen (= hier DNA
knippen)
 Primer herkenningssequenties (= nieuwe bindingsplaats voor primer)
 Adaptoren voor next generation sequencing (zie verder)
o 5’-overhang bij adaptor voorkomt ligatie v meerdere
adaptoren

, Meest gebruikte soorten:
- Bacteriofaag T4 DNA ligase:
o Meest gebruikt
o Ligeert dsDNA: blunt & sticky ends, ook nicks (breuk in 1 streng)
o Kan ook RNA ligeren, maar veel minder efficiënt
- E.coli DNA ligase:
o Lijmt dsDNA: sticky ends & nicks
o Blunt: inefficiënt, additieven nodig
- Ligeren v ‘sticky ends’ steeds efficiënter dan ‘blunt end’ DNA:
o Bij sticky ends: bepaalde overhang  al affiniteit waardoor DNA complex iets
stabieler is, DNA ligase makkelijker plakken
- RNA ligasen, bv. T4 RNA ligase:
o Ligeert ssDNA of RNA (DNA/DNA; RNA/RNA; DNA/RNA)
 Alles ligeren dat ss is + juiste uiteinden heeft
o Toepassing:
 Bv: om gelabelde probe te maken (inbouw gemodificeerde basen)
 Southern blot: scheiden obv grootte
 Specifiek RNA v interesse detecteren via DNA of RNA probe (= stukje
met seq die complementair is aan seq die je wil detecteren,
gekoppeld aan bv fluorescent of radioactiviteit)
 Korte probe met vrije 3’OH groep (RNA paars links) synthetiseren +
achteraf labelen (rechts met groen) met synthetische base (in labo
gemaakt) (rechts met groen eraan)  koppeling: 5’ fosfaatgroep aan
RNA vrij 3’OH einde = gelabeld molecule inbouwen in RNA dat ons
interesseert

Fosfatasen:

Fosfatasen:
- Verwijderen v 5’-fosfatase v DNA of RNA
- Bacterieel alkaline fosfatase:
o Verwijderen alle vrije 5’ en 3’ P v dsDNA, ssDNA en RNA (ook nucleotiden en
proteïnen)

Toepassingen:
- Verwijderen v 5’-fosfaat om nadien te radiolabelen van DNA met 32P:
o Probe al fosfaatgroep die je wil veranderen
o Fosfatase invoegen
o Fosfaatgroep eraf knippen
o Nieuwe fosfaatgroep toevoegen (bv radioactieve)

- Verwijderen v 5’-fosfaat om zelfligatie te vermijden:
o Dubbele vector met restrictieplaats: knippen met restrictie enzym
o Vector open + ook knippen dubbelstrengig fragment met zelfde restrictie enzym (om
dit erin te kloneren)
o Toevoegen ligase: herstelt vector zonder fragment erin (originele vector terug) !
DAAROM fosfatase enzym toevoegen
o Fosfaatgroepen verwijderen op vector: geen ligase mogelijk
o Met fragmentje aankomen (rode): ene streng ligeren, andere nt