Samenvatting HT4 over eiwitzuivering - Farmaceutische biotechnologie (K0B04A)

HOOFDSTUK 4: EIWITOPZUIVERING

Introductie:

Na productie: eiwitten opgezuiverd worden
- Recombinante eiwit (interesse): 1-5 % v proteïne massa
- Alle onzuiverheden verwijderen
o Belangrijk voor opzuiveren:
 Fysicochemische eig v recombinante product en onzuiverheden
 Bronnen v onzuiverheden bv: contaminatie tijdens productie, …
- Opzuivering kostelijker dan productie zelf

Staalvoorbereiding:

Centrifugatie:
= Scheiden v mengsels door centrifugale kracht
- Centrifuge: toestel die rotor in roterende beweging om vaste as laat roteren
o Principe: sedimentatie
 Oiv Zw scheiden stoffen zich obv dichtheid/zwaarte/vorm
 Centrifuge: g-kracht >> zwaartekracht
 Aan buitenkant zwaardere dingen (meer kracht op)
- Soorten scheidingen d.m.v. centrifugatie
o Pelleting:
 Meest voorkomende
 Pellet: op bodem centrifugebuis deeltjes geconcentreerd
 Supernatans: overgebeleven oplossing
 Vaak om bacteriën te oogsten of verwijderen
o Dichtheidsgradiënt:
 Scheiding obv dichtheid
 Betere resolutie dan klassieke
 Principe:
 Staal op matrix met gradiënt v dichtheid plaatsen (toe- of afnemen)
 Centrifugatie
 Moleculen in evenwicht met omgeving/matrix met zelfde dichtheid
 Gescheiden deeltjes geoogst
 Toepassingen:
 Minder voor eiwitzuiveringen
 Meer voor scheiding cellen, celorganellen, virussen, … (scheiding
bloed)
Dialyse:
= door selectieve en passieve diffusie via semi-permeabel membraan verwijderen v kleine
ongewenste verbindingen uit macromoleculen in oplossing
- Tot evenwicht in concentratie oplossing binnen/buiten membraan
- Door membraan:
o Wel: Kleine moleculen en bufferzouten
o Niet: moleculen groter dan poriegrootte vh membraan (bv eiwitten)
o Membranen: vers grootte bv: 3 kDa, 10 kDa, 50 kDa, …
o V staal << V buffer

, - Principe:
o Eiwitten in recipiënt afgelijnd door membraan
o Geheel in tank brengen met veel buffer
o Uitwisseling componenten v ene kant nr andere
o Buffer verversen + herhalen tot buffer hebben die ons interesseert
- Toepassingen:
o Verwijderen kleine onzuiverheden
o Veranderen v buffer:
 Na/voor zuiveringsstap
 Formulatiebuffer
Cellen openbreken:
- Bij zoogdiercellen & gisten: product meestal gesecreteerd nr medium  met supernatans
verder gewerkt
- Bij bacteriën: productie meestal intracellulair  verder werken met pellet, supernatans weg
o Eerst cellen openbreken
o Celwand bacteriën bemoeilijkt openbreken
o Fysieke disruptie methoden VS oplossing gebaseerde methoden
- Methoden:
o Fysieke methoden:
 French press:
 Onder grote druk (tot 1000 bar) door smalle opening geforceerd
 Hoge schuifkrachten op cellen
 Uit smalle opening: in fractie v seconde in atmosfersiche druk
 Cellen breken open (soms herhalen)
 Voordeel:
 Capaciteit: 1000den liters per uur
 Nadelen:
 Grote krachten: warmte-ontwikkeling  eiwitdenaturatie
 Systeem adequaat koelen
 Schudden in aanwezigheid v inerte parels (bv. glas):
 Mengen met parels
 Intens schudden/draaien
 Bacteriën breken door botsen of geplet te worden
 Optimale verhouding parels/bacteriën & schud-/draaisnelheid
noodzakelijk + afh v type bacterie
 Voordeel:
 Capaciteit: 1000den liters per uur
 Nadelen:
 Grote krachten: warmte-ontwikkeling  eiwitdenaturatie
 Systeem adequaat koelen
 Sonicatie:
 Pulsen hoog frequente geluidsgolven
 Probe onderdompelen  doorheen vloeibaar milieu sturen
 Ontstaan microscopische luchtbelletjes
 Imploderen
 Ontstaan schokgolfjes  openbreken cellen
 Nadelen:
 Warmte-ontwikkeling  eiwitdenaturatie: opl systeem
adequaat koelen en korte implusen ipv langdurige
 Enkel kleinere volumes (< 100 ml) + laboratoiumschaal
o Toevoegen detergenten: