Samenvatting HT 3 eiwitproductie - Farmaceutische biotechnologie (K0B04A)

HOOFDSTUK 3: EIWTIPRODUCTIE

Introductie: productie systemen:

Bronnen biofarmaceutische producten:
- CHO: chinese hamster ovary
o Hamstercellen gebruikt om gm te maken, uit eierstokken
o Zoogdiercellen
- HEK: human embryonic kidney
o Humane oorsprong
o Onsterfelijk gemaakte cellen ooit geïsoleerd uit nier v embryo
o Zoogdiercellen
- Bacterieel: bv Escherichia coli (E.coli)
- Gist: bv. Saccharomyces cerevisiae & Pichia pastoris
- Uitzonderlijk: transgene dieren
- Extra: zoals bv. planten(cellen) of insectcellen
 GEEN universeel productie systeem
 Eenvoudig nr complex: bacterieel  gist  zoogdiercellen  trangene dieren
 Nt elk proteïne kan in elk organisme gemaakt worden, herkennen genetische code, maar PTM die
organismen uitvoeren varieert  eindproduct verschilt v native product

Doelstellingen eiwitproductie:
- Juiste kwaliteit
- Hoge opbrengst
- Zo goedkoop mogelijk




Posttranslationele modificaties:

Doel:
- Vergroten functionele diversiteit v proteïnen door:
o Covalente groepen te koppelen
o Proteolyse

Posttranslationele modificaties:
- Belangrijke fysiologische rol:
o Regelen activiteit v eiwitten en/of zorgen voor correcte vouwing
o Juiste lokalisatie v eiwitten (in of uit cel) (door toevoeging groep)


1

, o Bepalen mee specificiteit v eiwitten, bv. aan welke andere eiwitten/DNA/vetten, etc.
ze binden
- Belangrijke rol voor biotherapeutica:
o Activiteit en specificiteit
o Maar ook: immunogeniciteit, farmacokinetiek en bewaartermijn (zie verder)
- 5 % v humane proteoom codeert voor eiwitten (vaak enzymen) die samen 200+ vers. types
aan PTMs uitvoeren
o Vb: kinase, fosfatase, transferase, ligase, protease, etc.
o Sommige reversibel, bv kinase kan eiwit fosforyleren om te activeren of deactiveren,
fosforgroep weer verwijderd door fosfatase
- Expressiesysteem zorgen voor gewenste en reproduceerbare PTMs:
o Reproduceerbaar: elke patiënt zelfde type eiwit krijgen
o Nt alle PTMs noodzakelijk voor activiteit
o Verschillen voor elk organisme, zelfs binnen organisme v cel tot cel
- Belangrijkste PTMs in context v farmaceutische producten:
o Glycosylatie (N-glycosylatie & O-glycosylatie)
o Vormen v zwavelbruggen
o Proteolytische processing: eiwitten moeten geknipt worden om actief te zijn

Glycosylatie:
- 2 soorten:
o N-glycosylatie:
 Suikergroep gehecht aan stikstof (N) atoom v asparagine
 Consensus sequentie: N – X – S/T
 N: Asparagine
 X: variable
 S/T: Serine of Threonine
 Nt alle N – X – S/T motieven geglycosyleerd:
 Ook afhankelijk v positie op eiwit  aan opp eiwit, anders nt
toegankelijk voor glycosylatranferase
 Waar: ER en golgi
 Heterogeniteit:
 Tss organismes: samenstelling en structuur (vertakkingen)
 Binnen organisme  type suikers ook verschillen + vertakkingen
 Samenstelling suikers verandert tijdens productieproces
o O-glycosylatie:
 Suikergroep gehecht aan zuurstof (O) atoom v OH groep, meestal S en T
 Geen gekende consensussequentie
 Waar: ER en golgi
 Eveneens heterogeniteit binnen/tss organismes
- Bijna enkel in Eukaryote cellen (gist/zoogdiercellen)
- Veel biotechnologische producten geglycosyleerd
o Bv. antilichamen, hormonen, …
- Suikers aangehecht door glycosyltransferase in ER
o Glycosyltransferase: enzyme dat suikers toevoegt en matureert
- Productieproces overstimuleren:
o Pathway volledig verzadigen met hoge expressielevels
o Proces nt meer 100% accuraat verlopen
o Sommige eiwitten golgi sneller verlaten  andere types glycosylatie
o Opvolging vereist tijdens prodcutie  eindproduct: homogeen


2

, - Effecten glycosylatie:
o Eiwitvouwing: beïnvloedt lokale secundaire structuur en kan eiwitten helpen correct
te vouwen
o Eiwittransport: kan sorteringsprocess in cel beïnvloeden
o Eiwit binding: bv bindingssterkte v constante domein v antilichaam (Fc-domein) aan
Fc-receptor
o Biologische activiteit: Bv. suikerketen v gonadotrofine is essentieel voor signaal-
transductie door gonadotrofine
o Stabiliteit: vers. mogelijkheden, bv. oplosbaarheid verbeteren door hydrofobe regio’s
af te schermen, eiwit beschermen tegen proteolyse, …
 Eiwitten: buitenkant = hydrofiel, binnenkant = hydrofoob
 Suikergroep op hydrofobe regio’s plaatsen zodat ze hydrofiel worden, wnr
hydrofobe AZ nt bij elkaar zitten
 Suikers wel goed oplosbaar in H2O
o Half-leven: hoge gehaltes aan siaalzuur verlengen vaak halfleven in plasma v eiwitten;
galactose zorgt voor verkort plasma halfleven door opname v galactose in lever
 Half-leven: tijd waarna helft v initiële concentratie GM aanwezig is
o Immunogeniciteit: bv. glycosylatie motieven v planten sterk immunogeen voor mens
- Hedendaags voorbeeld: Erythropoietine
o Wielermilieu
o Rol bij ontwikkeling rode bloedcellen
 Gebruik bij anemie, bv kanker, nierfalen, beenmergtransplant, …
o 36 kDa – 40 % suiker
 1 x O-glycosylatie
 Geen essentiële rol
 3 x N-glycosylatie
 Geen rol in vitro
 Maar in vivo absoluut noodzakelijk: toedienen zonder glycosylaties =
geen activiteit
 Belangrijk voor oplosbaarheid en halfleven

Vorming zwavelbruggen:
- 1/3de v alle eukaryote eiwitten bevat zwavelbruggen
- Reactie tss 2 zwavelhoudende AZ: cysteïne
o Covalente brug: nt van elkaar loskomen tenzij specifieke reactie
- Vaak noodzakelijk voor stabiliteit of activiteit:
o Zorgen bv voor correcte vouwing of verhinderen v ontvouwing
o Samenhouden v vers. ketens (zie verder, insuline)
o Stabiliteit v antilichamen  anders geen actief eiwit
- Voorwaarden:
o Juiste afstand tss cysteïnes
o Optimale pH (hoger is beter)
 Makkelijker 2 H+ vrijgeven in basisch milieu
o Oxiderende omgeving nodig
 Laatste 2 verschillend in vers. organismen
- Vorming in zoogdiercellen:
o Vrij efficiënt
o ER: oxiderende omgeving  spontane trage vorming mogelijk
o Verhoging efficiëntie: katalytische enzymen die S-bruggen vormen
 Oxidoreductase eiwitten met thioredoxin domein
 Thioredoxin domein: 2 cysteïne AZ bij elkaar met 2 AZ tss (CXXC)

3