Hoofdstuk 1
Vergelijk conventionele lichtmicroscopie met de transmissie elektronenmicroscopie
Lichtmicroscopie Elektronenmicroscopie
Maakt gebruik van zichtbaar licht of Maakt gebruik van een bundel elektronen
fluorescerend licht (400 - 700 nm) (veel kleinere golflente)
Kleinere resolutie Veel grotere resolutie
Wordt gebruikt voor de cellulaire structuur Wordt gebruikt voor de intracellulaire
van een weefsel te bestuderen structuur van een weefsel te bestuderen
Wordt gebruikt voor het onderzoeken van Wordt gebruikt voor het onderzoeken van
haren, bloedcellen en bacteriën virussen, DNA, glucose en atomen
Kan structuren onderzoeken van 100 μm tot Kan structuren onderzoeken van 10 μm tot
1 μm groot 0,1 nm groot
Bewaren van weefsel Bewaren van weefsel
" Invriezen " Fixeren
Gebeurt zeer snel
Enkel geschikt voor kleine weefselstukken
Structuur van eiwitten ongewijzigd
Enzymactiviteit vertraagd maar bewaard
DNA en RNA bewaard
" Fixeren
Weefsel ondergedompeld in fixator
Trager proces
Enzymatische activiteit verloren
DNA en RNA beschadigd
Snijden van coupes " Gefixeerd materiaal
" Invroren materiaal Moet eerst worden ingebed in epoxyhars
Kan meteen aangesneden worden d.m.v. waardoor een vaste structuur ontstaat die
een vriesmicrotoom we kunnen aansnijden met behulp van een
diamantmes of glasmes
" Gefixeerd materiaal
Moet eerst worden ingebed in paraffine
waardoor een vaste structuur ontstaat die
we kunnen aansnijden met behulp van een
microtoom
De gesneden coupes hebben een dikte van De gesneden coupes hebben een dikte van
5 à 10 μm dik 1 μm dik
,Bespreek de “fixatie” aan de hand van formaldehyde en glutaraldehyde bij de
staalpreparatie voor histologie. Voor welke histologische methoden worden deze
gebruikt?
Formaldehyde
Bij lichtmicroscopie wordt het weefsel ondergedompeld in de fixator formol
WAT een waterige oplossing op basis van formaldehyde
Hierdoor worden er covalente verbindingen gevormd tussen de N-terminale groep van
eiwitten, volgens een proces dat ‘crosslinking’ wordt genoemd
GEVOLG de eiwitten worden aan het cytoskelet en hun interagerende eiwitten vastgehecht
waardoor de structuur van het weefsel zo goed mogelijk bewaard blijft
De duur van de fixatie bedraagt 2 tot 24 uur, afhankelijk van de grootte van het te fixeren
materiaal, de gebruikt methode van fixatie en de fixator
De hoeveelheid van de fixator dient 5x het volume te zijn van het weefsel
Glutaaraldehyde
Bij elektronenmicroscopie bekijkt men de weefsels op ultrastructureel niveau
Wanneer cellen gescheiden worden van de bloedvoorziening treedt er osmotische zwelling
op van mitochondriën en het endoplasmatisch reticulum
PROBLEEM op ultrastructureel niveau is het geringste weefselverval zichtbaar
OPLOSSING fixatie moet goed en snel gebeuren
Bij elektronmicroscopie maakt men gebruik van de gekoelde fixator glutaaraldehyde (4° C)
Dit wordt vervolgd door een tweede fixatie in osmiumtetroxide
REDEN bewaren van vetten en gewicht toevoegen aan bepaalde structuren
,Geef de gelijkenissen en verschillen tussen immunohistochemie en
immunofluorescentie
Immunohistochemie Immunofluorescentie
Detectietechniek om een antigen op te Detectietechniek om een antigen op te
sporen sporen
Een antigen wordt herkend door
immunofluorescentie waarbij de primaire of
Een antigen wordt herkend d.m.v. een secundaire antistof wordt gekoppeld aan
enzymatisch reactie een fluorofoor die wanneer hij wordt
beschenen met licht van de juiste golflengte
fluorescent licht zal uitstralen
Er kunnen verschillende antigenen worden
Er kan maar 1 antigeen worden
gevisualiseerd door verschillende
gevisualiseerd
fluoroforen te gebruiken
Bespreek directe, indirecte en geamplificeerde immunohistochemie en
immunofluorescentie. Waarom bestaan deze verschillende afgeleide methoden?
Directe methode
• Het primaire antilichaam wordt rechtstreeks gekoppeld aan een detectieenzym
• Deze techniek is snel en eenvoudig maar geeft weinig signaalversterking
• Lage hoeveelheden antigenen worden moeilijker gedetecteerd
• Wordt gebruikt voor immuunglobuline en complementdeposities op te sporen in de
huidbiotopen en de nierbiotopen
• Het beste resultaat wordt bekomen in vriescoupes met fluoresceïne als detectieenzym
Indirecte methode
• Het primaire antilichaam is niet rechtstreeks gekoppeld aan een detectieenzym
• Een secundair antilichaam is gericht tegen het Fc fragment van het primaire
• Het secundaire antilichaam is gekoppeld aan een detectieenzym
• 2 voordelen
o je moet niet steeds het primaire antilichaam koppelen maar je kan steeds
hetzelfde secundaire antilichaam gebruiken dat reeds gekoppeld is
o signaalversterking
, Geamplificeerde methode
Signaalversterking kan bekomen worden door gebruik te maken van het biotine-streptavidine
systeem, deze 2 stoffen kunnen zeer sterk met elkaar interageren & grote complexen vormen
Het antistof en het detectieenzym worden met biotine gebonden. Het detectieenzym gaat
gecomplexeerd worden met strepdavidine door binding op biotine om zo een veel hogere
enzymactiviteit te bekomen en dus ook een veel sterker signaal
Immunofluorescentie
Dit is een detectietechniek om een antigen op te sporen
Een antigen wordt herkend door immunofluorescentie waarbij de primaire of secundaire
antistof wordt gekoppeld aan een fluorofoor die wanneer hij wordt beschenen met licht van
de juiste golflengte fluorescent licht zal uitstralen
Er kunnen verschillende antigenen worden gevisualiseerd door verschillende fluoroforen te
gebruiken
Vergelijk conventionele lichtmicroscopie met de transmissie elektronenmicroscopie
Lichtmicroscopie Elektronenmicroscopie
Maakt gebruik van zichtbaar licht of Maakt gebruik van een bundel elektronen
fluorescerend licht (400 - 700 nm) (veel kleinere golflente)
Kleinere resolutie Veel grotere resolutie
Wordt gebruikt voor de cellulaire structuur Wordt gebruikt voor de intracellulaire
van een weefsel te bestuderen structuur van een weefsel te bestuderen
Wordt gebruikt voor het onderzoeken van Wordt gebruikt voor het onderzoeken van
haren, bloedcellen en bacteriën virussen, DNA, glucose en atomen
Kan structuren onderzoeken van 100 μm tot Kan structuren onderzoeken van 10 μm tot
1 μm groot 0,1 nm groot
Bewaren van weefsel Bewaren van weefsel
" Invriezen " Fixeren
Gebeurt zeer snel
Enkel geschikt voor kleine weefselstukken
Structuur van eiwitten ongewijzigd
Enzymactiviteit vertraagd maar bewaard
DNA en RNA bewaard
" Fixeren
Weefsel ondergedompeld in fixator
Trager proces
Enzymatische activiteit verloren
DNA en RNA beschadigd
Snijden van coupes " Gefixeerd materiaal
" Invroren materiaal Moet eerst worden ingebed in epoxyhars
Kan meteen aangesneden worden d.m.v. waardoor een vaste structuur ontstaat die
een vriesmicrotoom we kunnen aansnijden met behulp van een
diamantmes of glasmes
" Gefixeerd materiaal
Moet eerst worden ingebed in paraffine
waardoor een vaste structuur ontstaat die
we kunnen aansnijden met behulp van een
microtoom
De gesneden coupes hebben een dikte van De gesneden coupes hebben een dikte van
5 à 10 μm dik 1 μm dik
,Bespreek de “fixatie” aan de hand van formaldehyde en glutaraldehyde bij de
staalpreparatie voor histologie. Voor welke histologische methoden worden deze
gebruikt?
Formaldehyde
Bij lichtmicroscopie wordt het weefsel ondergedompeld in de fixator formol
WAT een waterige oplossing op basis van formaldehyde
Hierdoor worden er covalente verbindingen gevormd tussen de N-terminale groep van
eiwitten, volgens een proces dat ‘crosslinking’ wordt genoemd
GEVOLG de eiwitten worden aan het cytoskelet en hun interagerende eiwitten vastgehecht
waardoor de structuur van het weefsel zo goed mogelijk bewaard blijft
De duur van de fixatie bedraagt 2 tot 24 uur, afhankelijk van de grootte van het te fixeren
materiaal, de gebruikt methode van fixatie en de fixator
De hoeveelheid van de fixator dient 5x het volume te zijn van het weefsel
Glutaaraldehyde
Bij elektronenmicroscopie bekijkt men de weefsels op ultrastructureel niveau
Wanneer cellen gescheiden worden van de bloedvoorziening treedt er osmotische zwelling
op van mitochondriën en het endoplasmatisch reticulum
PROBLEEM op ultrastructureel niveau is het geringste weefselverval zichtbaar
OPLOSSING fixatie moet goed en snel gebeuren
Bij elektronmicroscopie maakt men gebruik van de gekoelde fixator glutaaraldehyde (4° C)
Dit wordt vervolgd door een tweede fixatie in osmiumtetroxide
REDEN bewaren van vetten en gewicht toevoegen aan bepaalde structuren
,Geef de gelijkenissen en verschillen tussen immunohistochemie en
immunofluorescentie
Immunohistochemie Immunofluorescentie
Detectietechniek om een antigen op te Detectietechniek om een antigen op te
sporen sporen
Een antigen wordt herkend door
immunofluorescentie waarbij de primaire of
Een antigen wordt herkend d.m.v. een secundaire antistof wordt gekoppeld aan
enzymatisch reactie een fluorofoor die wanneer hij wordt
beschenen met licht van de juiste golflengte
fluorescent licht zal uitstralen
Er kunnen verschillende antigenen worden
Er kan maar 1 antigeen worden
gevisualiseerd door verschillende
gevisualiseerd
fluoroforen te gebruiken
Bespreek directe, indirecte en geamplificeerde immunohistochemie en
immunofluorescentie. Waarom bestaan deze verschillende afgeleide methoden?
Directe methode
• Het primaire antilichaam wordt rechtstreeks gekoppeld aan een detectieenzym
• Deze techniek is snel en eenvoudig maar geeft weinig signaalversterking
• Lage hoeveelheden antigenen worden moeilijker gedetecteerd
• Wordt gebruikt voor immuunglobuline en complementdeposities op te sporen in de
huidbiotopen en de nierbiotopen
• Het beste resultaat wordt bekomen in vriescoupes met fluoresceïne als detectieenzym
Indirecte methode
• Het primaire antilichaam is niet rechtstreeks gekoppeld aan een detectieenzym
• Een secundair antilichaam is gericht tegen het Fc fragment van het primaire
• Het secundaire antilichaam is gekoppeld aan een detectieenzym
• 2 voordelen
o je moet niet steeds het primaire antilichaam koppelen maar je kan steeds
hetzelfde secundaire antilichaam gebruiken dat reeds gekoppeld is
o signaalversterking
, Geamplificeerde methode
Signaalversterking kan bekomen worden door gebruik te maken van het biotine-streptavidine
systeem, deze 2 stoffen kunnen zeer sterk met elkaar interageren & grote complexen vormen
Het antistof en het detectieenzym worden met biotine gebonden. Het detectieenzym gaat
gecomplexeerd worden met strepdavidine door binding op biotine om zo een veel hogere
enzymactiviteit te bekomen en dus ook een veel sterker signaal
Immunofluorescentie
Dit is een detectietechniek om een antigen op te sporen
Een antigen wordt herkend door immunofluorescentie waarbij de primaire of secundaire
antistof wordt gekoppeld aan een fluorofoor die wanneer hij wordt beschenen met licht van
de juiste golflengte fluorescent licht zal uitstralen
Er kunnen verschillende antigenen worden gevisualiseerd door verschillende fluoroforen te
gebruiken
