Thema 3 Samenvatting
Massaspectrometrie en proteomics
,Deel 1: Basisprincipe van HPLC
HPLC = high performance (/pressure) liquid chromatography
Wat is een HPLC? Een set van instrumenten die zijn samengevoegd in een kast
- Bovenop de kast twee buffervaten, één met buffer A en één met buffer B
- Van buffer A en B gaan slangetjes naar een gedeelte (1) – de mengkamer
o In de mengkamer zitten pompen die buffer weg kunnen pompen
en buffer kunnen mengen als dat nodig is.
- Dat gaat naar een gedeelte (2) – een injection valve
- Als derde bijvoorbeeld een 96-wells plaat met allemaal monsters erin (=
gedeelte (3) – monsters)
- Het monster kan je opnemen in de injection valve en dat gaat naar
nr (4) – de kolom
- Uit de kolom komen peptides die gedetecteerd worden in (5) – de detector
o De detector meet UV-signaal en peptides kunnen heel goed
gemeten worden bij 218 nm
- Alles wordt aangestuurd door (6) – een computer
Het monster moet op de kolom komen en er weer vanaf gaan in delen
" daarvoor zijn buffer A en B
- Buffer A, buffer B, gradiëntelutie
o Op de x-as staat de tijd (min)
o Op de y-as zou bv. kunnen staan 100% buffer A en 100% buffer B
- Proces:
o Kolom spoelen met 100% buffer A
o Ondertussen monster opbrengen
o Geleidelijk worden A en B gemengd
o Uiteindelijk ga je naar 100% buffer B
(= gradiëntelutie; daardoor komen die peptides in porties van de kolom af)
, Injection valve:
een rond ding met openingen die je op verschillende manieren met elkaar kan verbinden. Bijvoorbeeld
eentje waarbij je een binding kan hebben met wat we noemen de sample loop
- Monster opbrengen: De eerste stap is dat je het monster uit het monstervat naar de injection
valve brengt. Vervolgens is het zo geschakeld dat hij van die injection valve in die sample loop
komt en dat ‘deze’ (vat) ook met elkaar verbonden is.
- Peptides binden aan kolom: Vervolgens kan je zo’n kraan draaien en krijg je andere
verbindingen. Nu gaat het monster de kolom op. En vanuit de pomp ga je naar de sample
loop, dus je kan buffer A spoelen en al het monster wegspoelen en op de kolom terecht laten
komen.
- Na verloop van tijd ga je steeds meer buffer B toevoegen.
Alles gaat van de pomp naar de kolom. Bij de pomp ga je van buffer A naar buffer B. en alles
van de kolom wordt opgevangen in een nieuwe plaat met buisjes. Iedere minuut ofzo (of paar
minuten) gaat hij van het ene naar het andere buisje en zo kan je je peptides in porties
opvangen.
Massaspectrometrie en proteomics
,Deel 1: Basisprincipe van HPLC
HPLC = high performance (/pressure) liquid chromatography
Wat is een HPLC? Een set van instrumenten die zijn samengevoegd in een kast
- Bovenop de kast twee buffervaten, één met buffer A en één met buffer B
- Van buffer A en B gaan slangetjes naar een gedeelte (1) – de mengkamer
o In de mengkamer zitten pompen die buffer weg kunnen pompen
en buffer kunnen mengen als dat nodig is.
- Dat gaat naar een gedeelte (2) – een injection valve
- Als derde bijvoorbeeld een 96-wells plaat met allemaal monsters erin (=
gedeelte (3) – monsters)
- Het monster kan je opnemen in de injection valve en dat gaat naar
nr (4) – de kolom
- Uit de kolom komen peptides die gedetecteerd worden in (5) – de detector
o De detector meet UV-signaal en peptides kunnen heel goed
gemeten worden bij 218 nm
- Alles wordt aangestuurd door (6) – een computer
Het monster moet op de kolom komen en er weer vanaf gaan in delen
" daarvoor zijn buffer A en B
- Buffer A, buffer B, gradiëntelutie
o Op de x-as staat de tijd (min)
o Op de y-as zou bv. kunnen staan 100% buffer A en 100% buffer B
- Proces:
o Kolom spoelen met 100% buffer A
o Ondertussen monster opbrengen
o Geleidelijk worden A en B gemengd
o Uiteindelijk ga je naar 100% buffer B
(= gradiëntelutie; daardoor komen die peptides in porties van de kolom af)
, Injection valve:
een rond ding met openingen die je op verschillende manieren met elkaar kan verbinden. Bijvoorbeeld
eentje waarbij je een binding kan hebben met wat we noemen de sample loop
- Monster opbrengen: De eerste stap is dat je het monster uit het monstervat naar de injection
valve brengt. Vervolgens is het zo geschakeld dat hij van die injection valve in die sample loop
komt en dat ‘deze’ (vat) ook met elkaar verbonden is.
- Peptides binden aan kolom: Vervolgens kan je zo’n kraan draaien en krijg je andere
verbindingen. Nu gaat het monster de kolom op. En vanuit de pomp ga je naar de sample
loop, dus je kan buffer A spoelen en al het monster wegspoelen en op de kolom terecht laten
komen.
- Na verloop van tijd ga je steeds meer buffer B toevoegen.
Alles gaat van de pomp naar de kolom. Bij de pomp ga je van buffer A naar buffer B. en alles
van de kolom wordt opgevangen in een nieuwe plaat met buisjes. Iedere minuut ofzo (of paar
minuten) gaat hij van het ene naar het andere buisje en zo kan je je peptides in porties
opvangen.
