Samenvatting - Moleculaire biologie en DNA technologie

Samenvatting Moleculaire biologie en DNA technologie

Hoofdstuk 1: Isolatie van nucleïnezuren

1.1 Nucleïnezuren
DNA en RNA
 Structuur van DNA:
5’ vrije fosfaatgroep
3’ vrije OH-groep
Antiparallelle strengen
Waterstofbruggen
Bewaren genetische informatie

 Structuur van RNA:
Veel lagere stabiliteit dan DNA
Snelle turnover -> reguleerbaar
Enkelstrengig
Interacties met eiwitten, dna en kleine rna-bindende moleculen aangaan
MiRNA, rRNA, tRNA, IncRNA

 Het Genoom van pro- en eukaryoten
Kern: histoneiwitten en nucleosoom, chromatine en chromosomen, euchromatine en
heterochromatine
Mitochondiën
Chloroplasten
Chromosomen zitten in de mitose-metafase in de celcyclus

1.2 Isolatie nucleïnezuren
1.3
Isoleren van DNA uit cellen of weefsels
 DNA isolatie:
Zuiver DNA nodig voor enzymatische down stream toepassingen
Enzymwerking wordt verstoord wanneer DNA niet zuiver is.

VRAGEN:
Hoe cellen openbreken om DNA uit te isoleren: lysemethode, voorbereidende stappen
Chemisch, biologisch, fysisch, mechanisch, combinatie

 Cellyse: Verschil eukaryoten en prokaryoten, verschil in celarchitectuur, verschillende
lysemethoden, verschillende voorbehandelingen nodig.

,n




Chemisch:
1. Detergent (SDS)
2. Alkalische buffer (NaOH)

Biologisch:
3. Proteïnase K
 Breekt eiwitten af op de celmembraan en gebonden op nucleïnezuren.
 Breed- spectrum proteïnase
 Knipt na hydrofobe aminozuren
 Eiwitten degraderen
 Nucleasen onschadelijk maken
 Temperatuur 56° C
 Stabiel over een breed pH bereik ( ideaal bij 8)
 Buffer:
 Activiteit omhoog door detergenten, en chaotrope stoffen
o Want -> denatureren het substraat waardoor dit beter
toegankelijk wordt voor het enzym

Combinatie van verschillende methoden:
4. In humane cellen:
 Proteïnase K en detergent en warmte Lysebuffer voor nucleïnezuurisolatie
 Chaotrope stof of chaotroop zout
 GuSCN, ethanol, SDS, Ureum, guanidiumchloride, MgCl2, fenol
 Verhoogt de entropie door interfereren met intermoleculaire
krachten:
o Waterstofbruggen
o Van der Waals krachten
o Hydrofobe effecten

,  Verbreken watermantel rond DNA, denatureren eiwitten,
bescherming DNA door inactivatie nucleasen, verhogen
membraanpermeabiliteit hydrofoobeffect

Lysozyme (biologisch)
5. Hydrolyseert peptidoglycaan
6. Breekt celwand van grampositieven open

Hoe zuiveren we het DNA? Hoe verwijderen we de overige celcompomenten?
 Cellysaat bevat: DNA in waterige oplossing, RNA in waterige oplossing, afbraakmateriaal van
cel, detergens, proteïnase K, chaotroop agens,…
 Verschillende DNA- isolatietechnologieën (zie scheidingstechnieken)
1. Vroeger:
Fenol- chloroform extractie maar schadelijke producten
2. Sinds 1990: Boom- “Extractie”
Kolomchromatografie

 Extractie: fenol-chloroform
1. Waterige fase: DNA
2. Interfase: celdebris
3. Organische fase: proteïnen, lipiden
4. VOORDELEN:
 Zeer zuiver DNA
 Zeer goede opbrengst
5. NADELEN:
 Tijdrovend
 Isopropanol precipitatie
 Schadelijke organische solventen
 Residuele organische solventen interfereren met DNA- concentratiebepaling
en enzymatische DNA- manipulatie

 Boom- “Extractie”: Silicakolommen
1. Adsorbtie van DNA op silicagel
 Samenstelling bindingsbuffer:
 Hoge zoutconcentratie en chaotroop agens
 Functie bindingsbuffer:
 Verwijderen watermantel van DNA
 Verwijderen watermantel kolom
 Vormen kationbrug tss silicakolom en negatief geladen DNA
2. Verwijderen van contaminanten
 Wassen:
 Ethanol en hoge zoutconcentratie

,  DNA blijft gebonden aan de kolom
 Contaminanten worden weggewassen
 Verwijderen enzyminhibitoren
3. Elutie van DNA
 Lage zoutconcentratie
 Geen carry-over van ethanol




4. VOORDELEN:
 Snel
 Minder schadelijke organische solventen
 Zuiver en geconcentreerd DNA
 Makkelijk te automatiseren




Hoe bewaren we DNA?
Hoeveel DNA kunnen we zuiveren uit een bepaald monster/staal?
Hoe bewaren we het startmateriaal?

 Buffer:
1. Dnase-vrij water
2. Tris-EDTA buffer ( DNA blijft langer stabiel maar mogelijks nadeel door downstream
applicaties)
 Temperatuur:
1. Standaard: bij -20°C
2. -80°C voor heel lange periode
 Startmateriaal kan bewaard worden (6maand) na toevoegen proteïnase K
 Elutievolume hangt af van de hoeveelheid DNA

Kwantitatief:
 DNA-concentratie