2 Flowcytometrie
Basisprincipe
▪ Routine-onderzoek: neutrofiele granulocyten, monocyten, leukocyten, lymfocyten,
eosinofiele- en basofiele granulocyten
▪ Flowcytometer: onderscheid tussen verschillende afwijkende leukocyten → via
specifieke AL
▪ Op het oppervlak en in de cellen: Cluster of differentiation-merker → bepaalde
structuur kenmerkend voor bepaald type cel (vb leukocyt)
Deel 1 p157
▪ Welke veranderingen aan het oorspronkelijk Coulter principe werden doorgevoerd.
▪ Welke signalen worden gemeten en welke info ze opleveren.
▪ Weten op basis van welke meetprincipes/signalen/kanalen de verschillende cellen
de verschillende cellen worden gemeten en waarom ze precies in die kanalen /
volgens dat principe worden gemeten.
▪ Welke bepalingen worden standaard uitgevoerd en welke moeten speciaal worden
aangevraagd of worden enkel gemeten bij een afwijking
▪ Hoe de SFL wordt uitgevoerd.
▪ Welke cellen eerder een lage/hoge fluorescentie intensiteit hebben en waarom.
▪ Link tussen veranderingen van de gemeten signalen en abnormaliteiten van
cellen.
▪ Weten hoe een normaal histogram van bv. de RBC/PLT eruit ziet.
▪ In welke zin zal een normaal patroon van RBC/PLT veranderen bij bv. stijging van
RDW, reuzetrombocyten.
▪ Weten wat reticulocyten zijn en wanneer/hoe ze worden bepaald.
▪ Wat is de oplossing voor factoren die interferentie opleveren bij het meten van
bepaalde cellen.
▪ Benoemen van de verschillende populaties van leukocyten op een plot.
▪ Weten welke wijzigingen op het plot gebeuren bij abnormailteiten.
▪ Weten wat NRBC’s zijn, wanneer/hoe ze worden gemeten, wat de problemen zijn
▪ Weten wat er met de cellen gebeurt om ze te kunnen meten: wassen, verdunnen,
lyseren en waarom.
1.1.1 Elektronische telling: de impedantiemethode
De basis van het elektronisch tellen van cellen is gelegd door de Amerikaan Coulter. Het
principe is gebaseerd op de eigenschap dat bloedcellen elektrische stroom minder goed
geleiden dan de elektrolytoplossing waarin ze gesuspendeerd zijn.
Coulter ontwierp een apparaat waarin een glazen buis met een zeer kleine opening
(telbuis) geplaatst is in een suspensie van bloedcellen. Door vaccuum wordt die
suspensie in de telbuis opgezogen. Er zijn twee elektroden nodig om met dit systeem
metingen uit te voeren. De ene elektrode bevindt zich in de glazen buis, de andere in de
verdunde bloedcel oplossing. Elektrische stroom vloeit tussen de twee elektroden en
wordt geleid door de elektrolyt. De zeer smalle opening (‘aperture’) is de brug langs waar
de elektronen vloeien van de ene zijde van de opening naar de andere (figuur 2.1).
Wanneer een cel door de opening gaat wordt een volume elektrolyt gelijk aan dit van de
cel verplaatst. Daar een cel een geringere stroomgeleiding heeft dan de elektrolyt
ontstaat een scherpe toename in de elektrische weerstand (impedantie) van het
systeem. Daardoor ontstaat, een spanningspuls:
, De impedantieverandering wordt geregistreerd als een signaal dat aangeeft dat er een
cel gepasseerd is. Bovendien blijkt dat de hoogte van het signaal een maat is voor het
volume van de cel. Grotere cellen zullen een grotere weerstand veroorzaken (grotere
stijging impedantie) dan een kleine cel.
De pulsen worden doorgegeven naar een pulsgrootte analyzer waaruit dan een
frequentieverdeling volgens de verschillende geanalyseerde celgrootten kan worden
opgesteld (figuur 2.2). Wanneer men nu een gekend volume van de suspensie laat
opzuigen, is het aantal geregistreerde signalen een maat voor de celconcentratie in de
suspensie.
Figuur 2.2: Pulshoogteverdeling (oscilloscoop) en resulterend histogram.
1.1.1.1 Specifieke telling RBC, WBC en trombocyten
Omdat men alleen op basis van het volume van de cel geen onderscheid kan maken
tussen de verschillende bloedcellen gaat men de telling in verschillende kanalen
e
uitvoeren. In het 1 kanaal wordt het bloed zeer sterk verdund in een
elektrolytenoplossing voor de telling van de erytrocyten en trombocyten. Omdat het
volume van de trombocyten veel kleiner is dan dit van de erytrocyten, kunnen deze
celsoorten goed van elkaar gescheiden worden. In theorie worden ook leukocyten
meegeteld in het erytrocyten kanaal, maar omdat de verhouding RBC/WBC ongeveer
1000:1 is, en de meeste WBC een groter volume hebben dan de erytrocyten, wordt de
bijdrage van de WBC bij de erytrocytentelling verwaarloosbaar klein.
Voor de telling van de leukocyten wordt een ander kanaal gebruikt, waarin het bloed
minder sterk verdund wordt met een elektrolytenoplossing waarin zich ook een detergens
bevindt. Het detergens lost de membranen van de erytrocyten op (lyse van de RBC),
zodat de leukocyten specifiek geteld kunnen worden.
Trombocyten, die niet gelyseerd worden, kunnen door het verschil in grootte duidelijk
onderscheiden worden van de WBC, zodat ze de telling niet verstoren.
1.1.1.2 Factoren die de accuraatheid van de telling negatief beïnvloeden
Wanneer twee cellen tegelijkertijd de telbuis passeren, men noemt dit coïncidentie
(figuur 2.3), zullen er afwijkingen optreden bij de celtelling. In principe kunnen zich twee
situaties voordoen: horizonatle interactie en vertikale interactie. Bij horizontale interactie
Basisprincipe
▪ Routine-onderzoek: neutrofiele granulocyten, monocyten, leukocyten, lymfocyten,
eosinofiele- en basofiele granulocyten
▪ Flowcytometer: onderscheid tussen verschillende afwijkende leukocyten → via
specifieke AL
▪ Op het oppervlak en in de cellen: Cluster of differentiation-merker → bepaalde
structuur kenmerkend voor bepaald type cel (vb leukocyt)
Deel 1 p157
▪ Welke veranderingen aan het oorspronkelijk Coulter principe werden doorgevoerd.
▪ Welke signalen worden gemeten en welke info ze opleveren.
▪ Weten op basis van welke meetprincipes/signalen/kanalen de verschillende cellen
de verschillende cellen worden gemeten en waarom ze precies in die kanalen /
volgens dat principe worden gemeten.
▪ Welke bepalingen worden standaard uitgevoerd en welke moeten speciaal worden
aangevraagd of worden enkel gemeten bij een afwijking
▪ Hoe de SFL wordt uitgevoerd.
▪ Welke cellen eerder een lage/hoge fluorescentie intensiteit hebben en waarom.
▪ Link tussen veranderingen van de gemeten signalen en abnormaliteiten van
cellen.
▪ Weten hoe een normaal histogram van bv. de RBC/PLT eruit ziet.
▪ In welke zin zal een normaal patroon van RBC/PLT veranderen bij bv. stijging van
RDW, reuzetrombocyten.
▪ Weten wat reticulocyten zijn en wanneer/hoe ze worden bepaald.
▪ Wat is de oplossing voor factoren die interferentie opleveren bij het meten van
bepaalde cellen.
▪ Benoemen van de verschillende populaties van leukocyten op een plot.
▪ Weten welke wijzigingen op het plot gebeuren bij abnormailteiten.
▪ Weten wat NRBC’s zijn, wanneer/hoe ze worden gemeten, wat de problemen zijn
▪ Weten wat er met de cellen gebeurt om ze te kunnen meten: wassen, verdunnen,
lyseren en waarom.
1.1.1 Elektronische telling: de impedantiemethode
De basis van het elektronisch tellen van cellen is gelegd door de Amerikaan Coulter. Het
principe is gebaseerd op de eigenschap dat bloedcellen elektrische stroom minder goed
geleiden dan de elektrolytoplossing waarin ze gesuspendeerd zijn.
Coulter ontwierp een apparaat waarin een glazen buis met een zeer kleine opening
(telbuis) geplaatst is in een suspensie van bloedcellen. Door vaccuum wordt die
suspensie in de telbuis opgezogen. Er zijn twee elektroden nodig om met dit systeem
metingen uit te voeren. De ene elektrode bevindt zich in de glazen buis, de andere in de
verdunde bloedcel oplossing. Elektrische stroom vloeit tussen de twee elektroden en
wordt geleid door de elektrolyt. De zeer smalle opening (‘aperture’) is de brug langs waar
de elektronen vloeien van de ene zijde van de opening naar de andere (figuur 2.1).
Wanneer een cel door de opening gaat wordt een volume elektrolyt gelijk aan dit van de
cel verplaatst. Daar een cel een geringere stroomgeleiding heeft dan de elektrolyt
ontstaat een scherpe toename in de elektrische weerstand (impedantie) van het
systeem. Daardoor ontstaat, een spanningspuls:
, De impedantieverandering wordt geregistreerd als een signaal dat aangeeft dat er een
cel gepasseerd is. Bovendien blijkt dat de hoogte van het signaal een maat is voor het
volume van de cel. Grotere cellen zullen een grotere weerstand veroorzaken (grotere
stijging impedantie) dan een kleine cel.
De pulsen worden doorgegeven naar een pulsgrootte analyzer waaruit dan een
frequentieverdeling volgens de verschillende geanalyseerde celgrootten kan worden
opgesteld (figuur 2.2). Wanneer men nu een gekend volume van de suspensie laat
opzuigen, is het aantal geregistreerde signalen een maat voor de celconcentratie in de
suspensie.
Figuur 2.2: Pulshoogteverdeling (oscilloscoop) en resulterend histogram.
1.1.1.1 Specifieke telling RBC, WBC en trombocyten
Omdat men alleen op basis van het volume van de cel geen onderscheid kan maken
tussen de verschillende bloedcellen gaat men de telling in verschillende kanalen
e
uitvoeren. In het 1 kanaal wordt het bloed zeer sterk verdund in een
elektrolytenoplossing voor de telling van de erytrocyten en trombocyten. Omdat het
volume van de trombocyten veel kleiner is dan dit van de erytrocyten, kunnen deze
celsoorten goed van elkaar gescheiden worden. In theorie worden ook leukocyten
meegeteld in het erytrocyten kanaal, maar omdat de verhouding RBC/WBC ongeveer
1000:1 is, en de meeste WBC een groter volume hebben dan de erytrocyten, wordt de
bijdrage van de WBC bij de erytrocytentelling verwaarloosbaar klein.
Voor de telling van de leukocyten wordt een ander kanaal gebruikt, waarin het bloed
minder sterk verdund wordt met een elektrolytenoplossing waarin zich ook een detergens
bevindt. Het detergens lost de membranen van de erytrocyten op (lyse van de RBC),
zodat de leukocyten specifiek geteld kunnen worden.
Trombocyten, die niet gelyseerd worden, kunnen door het verschil in grootte duidelijk
onderscheiden worden van de WBC, zodat ze de telling niet verstoren.
1.1.1.2 Factoren die de accuraatheid van de telling negatief beïnvloeden
Wanneer twee cellen tegelijkertijd de telbuis passeren, men noemt dit coïncidentie
(figuur 2.3), zullen er afwijkingen optreden bij de celtelling. In principe kunnen zich twee
situaties voordoen: horizonatle interactie en vertikale interactie. Bij horizontale interactie
