Gentherapie en Kanker Deel 1
HC 1 15-11-2017
Infectieuze en parasitaire ziekten: malaria en tuberculose zijn de grootste boosdoeners onder de
overdraagbare ziekten. Cardiovasculaire ziekten zorgen voor de meeste doden onder de niet-
overdraagbare ziekten. Alzheimer is de belangrijkste ouderdomsziekte. De mannelijke mortality rate
is het hoogst in Swaziland door HIV/aids, evenals in Zuid-Afrika.
Er zijn 100en verschillende eiwitten betrokken in transcriptie. Tot 1975 was er niet veel meer bekend
dan over bacteriën en een promotor. Rond 1983 werden 3 klassen sequenties bekend:
- Promotor (RNA-polymerase, TATA-box binding protein (TBP))
- Enhancer (activators)
- Silencer (repressor)
Hoe beïnvloeden distale sequenties transcriptie? Zuivering van transcriptiefactor: Sp1: specificity
factor. Dit bindt aan de GC-box en stimuleert dus genen met een GC-box. Sp1 heeft 3 zink-vingers
(bestaande uit cysteïne (zwavel heeft vrij elektronenpaar) en histidine (heeft ook vrij
elektronenpaar)). Daarnaast heeft Sp1 een glutamine (Q)-rijk domein. (Glutamaat heeft een OH-
groep i.p.v. een NH2 groep). Mutanten van dit glutamine domein binden wel, maar stimuleren
transcriptie niet. Daarom wordt het ook wel een transactivatie domein genoemd. Sp1 is nodig voor
een toename van transcriptie en is gen-afhankelijk. De rol van Sp1 is dus een activator.
Bindt Sp1 aan basale factoren, zoals TBP? Nee, gezuiverd TBP bindt gen Sp1. Sp1 is een dimeer en
bindt dus 2 GC-boxen. Binding van TBP (monomeer) induceert een buiging van DNA.
- Activators binden aan enhancers, ze bepalen welke genen geactiveerd worden, bepalen de
efficiëntie van transcriptie.
- Repressors binden aan een geselecteerde sets van genen op silencers, en interfereren met
activators, inhiberen transcriptie
- Co-activators zijn adapter moleculen die signalen integreren van activators (en repressors) en
geven de signalen door aan de basale machinerie
- Basale activators positioneren RNA-polymerase op de promotor als reactie op activator
functie.
Fouten plaatje: RNA begint niet met een coderend gebied, maar met de start van transcriptie. Basale
activators moet general transcriptiefactoren/activators zijn.
Samenvatting: basale factoren: TBP. Co-activators of mediators of TAF’s, TBP-geassocieerde factoren.
Tijdens transcriptie: 5’-capping, splicing, 3’-poly-adenylering. mRNA heeft een open reading frame
(ORF) dat begint met AUG en eindigt met een stopcodon. Aan de 5’ kant zit een 5’UTR en aan de 3’
kant een 3’UTR (hier binden de miRNA’s, het is belangrijk voor stabiliteit en lokalisatie).
Initiatie van translatie begint met de 40S subunit van het ribosoom (small ribosomal unit) waaraan
initiator tRNA gebonden is. Het mRNA heeft dan al eiwitten gevonden, zoals het CBP (cap-binding
protein), eIF-4E bindt aan de 5’ cap en eIF-4G bindt daar weer aan. Translatie gebeurt ook in een
loop. Aan dit eiwitcomplex kan dan het ribosoom binden. Initiator tRNA beweegt langs het RNA op
zoek naar de eerste AUG, waarna ook het 60S ribosoom deel bindt. eIF-2 en andere initiatie factoren
dissociëren na een startcodon.
1
,Genetische therapieën:
1. Antisense therapie blokkeert translatie
2. Triplex-strategie blokkeert transcriptie
3. Gentherapie
4. RNAi
5. Gen reparatie
a. Oligonucleotide
b. Via zinc-finger-induced cleavage
c. TALENS
d. CRISPR-CAS9
Toetsvraag: Wat is het therapeutische molecuul bij antisense therapie? Geef details omtrent dit
molecuul. Een oligo van 16-20 nucleotiden, bijvoorbeeld S/thio-oligo, een morpholino (wat is dat, hoe
ziet het eruit). Dus modificaties noemen en waarvoor ze nodig zijn.
Een triplex vorming drug: stukje DNA/RNA dat bindt aan DNA, waardoor transcriptie geblokkeerd
wordt. Antisense drug is gericht tegen mRNA in het cytosol/de kern om translatie te blokkeren.
Structuur van een oligonucleotide:
- DNA-oligonucleotides = oligomeer = oligo ongeveer 16-20 nt, genoeg om een unieke plek in
genoom te vinden
- Base-afhankelijke binding, specifiek
- Sense & antisense
- Antisense oligo (ASO)
- DNases, RNases
- S- or thio-oligo (betere opname, minder negatief geladen, stabieler)
- 2’-O-methoxyethyl/DNA gapmer DNA-nucleotiden geflankeerd door een ongebruikelijke
ribose suiker, nog minder geladen, betere opname en minder afbraak.
- Morpholino, 5-ring is 6-ring, stikstof in ring, zuurstof van fosfaat is stikstof stabieler, DNase
resistenter, hydrofober dus makkelijkere opname. Een antisense morpholino is efficiënter in
gebieden voor de AUG, daarna neemt efficiëntie af. Dit is ook het moment dat de 60S
ribosoom deel bindt. De scanning van het 40S ribosoom kan dus geblokkeerd worden door
het morpholino, maar het hele ribosoom zou het morpholino van het mRNA af werpen.
o Voordelen: stabiliteit, DNAse resistent, opname beter, hydrofober
o Nadeel: kosten
Fout plaatje (34): fosfaat hoort niet bij die nucleotide.
Structuur van een triplex molecuul maakt een 3-DNA strengen structuur door H-bruggen te vormen
met het DNA. Dit is alleen stabiel als er AT-reeksen zijn is er niet in de praktijk. Er is dus een
sequentieprobleem.
Antisense oligo kan ribosoom blokkeren, zowel tijdens scanning als in het ORF. Wanneer een RNA-
DNA-hybride wordt gevormd, zorgt ribonuclease H voor het knippen van het mRNA. Bij RNAi wordt
ook mRNA geknipt. Vaak zijn sense strengen verontreinigd met antisense strengen waardoor alsnog
remming plaatsvindt.
Antisense tegen p53? P53 is een tumor suppressor, maar werd ook wel gezien als een proto-oncogen
omdat de mutante versie ervan tumor vorming stimuleert. Antisense tegen c-myc transcriptiefactor
zorgt voor vermindering van leukemie in muizen.
2
, Gentherapie:
- ADA-SCID
- Virussen als voertuig
- X-SCID
Gentherapie is menselijk-geïnduceerde veranderingen in het genotype. De genetische correctie van
een mutant, ziekte-veroorzakend genotype. Ashanti DeSilva was de eerst persoon die gentherapie
ontving.
Toetsvraag: wat is het therapeutisch molecuul bij gentherapie? Geef details. Ze is behandeld met een
retrovirus vector, die een expressie cassette bevat (cassette omschrijven met intron, psi, poly-A
signaal, ADA-gen, self-inactivating LTR).
Hematopoietische stamcel in beenmerg, hieruit groeien NK-cellen, B-cellen en T-cellen. Bij SCID is er
een blokkade die voorkomt dat NK-cellen en T-cellen (en indirect dus ook B-cellen) worden gevormd.
Dit komt door een mutatie in het enzym andenosine deaminase (ADA), wat nodig is bij de vorming
van inosine, een metaboliet in de purine synthese (nucleotiden).
- CLP: Common Lymphocyte Precursor
- HSC: Hematopoietische stamcel
ADA-SCID: adenosine-deaminase-severe combined immunodeficiency. Ashanti DeSilva was de eerste
die hier gentherapie voor ontving. Zij werd behandeld in 1990 retrovirus met ADA in volwassen T-
cellen, ondersteund door PEGylated (PEG)-ADA (polyethyleenglycol, zorgt voor langzame afgifte van
ADA want maakt ADA onoplosbaar).
HC 2 17-11-2017
Een virus wordt gebruikt als vector om humane cellen mee te behandelen, door directe injectie of
cellen afnemen en in vitro injecteren en de cellen terugplaatsen. Virussen zijn hier zeer geschikt voor,
omdat ze van nature cellen infecteren en zorgen dat ze eiwitten tot expressie brengen die ze normaal
niet produceren. Welke virussen/vectoren?
- Retrovirussen (10 kb) integreren genen in host chromosomen, bieden kans voor lange
termijn stabiliteit. Kan genen verstoren in het genoom (maar een klein deel van het genoom
bestaat uit exonen), alleen delende cellen worden geïnfecteerd (lentivirussen kunnen wel
niet-delende cellen infecteren).
- Adenovirussen (50 kb) veroorzaken meestal geen ernstige ziekten, grote capaciteit voor
vreemde genen. Genen kunnen tijdelijk functioneren, door geen integratie of aanval van
immuunsysteem.
- Adeno-geassocieerde virussen (AAV’s, 4,7 kb) integreren genen in host chromosomen,
veroorzaken geen humane ziekten. Kleine capaciteit voor vreemde genen. Heeft een helper-
virus nodig, AAV9 heeft brein tropisme (voorkeur voor hersencellen).
- Liposomen veroorzaken geen ziekte, minder efficiënt dan virussen bij gentransfer.
- ‘Naakt DNA’ veroorzaakt geen ziekte, makkelijk voor vaccinatie. Inefficiënte gentransfer,
instabiel in de meeste weefsels.
In het algemeen komen virussen niet het brein in BBB (bloed-brein-barrière).
Virussen bestaan uit een expressie cassette: 5’-promotor-intron-transgen-polyadenylatiesite-3’.
Genen komen efficiënter tot expressie wanneer ze een intron bevatten (‘The nuclear experience’).
Het intron zit in het ORF en niet voor het transgen.
3
HC 1 15-11-2017
Infectieuze en parasitaire ziekten: malaria en tuberculose zijn de grootste boosdoeners onder de
overdraagbare ziekten. Cardiovasculaire ziekten zorgen voor de meeste doden onder de niet-
overdraagbare ziekten. Alzheimer is de belangrijkste ouderdomsziekte. De mannelijke mortality rate
is het hoogst in Swaziland door HIV/aids, evenals in Zuid-Afrika.
Er zijn 100en verschillende eiwitten betrokken in transcriptie. Tot 1975 was er niet veel meer bekend
dan over bacteriën en een promotor. Rond 1983 werden 3 klassen sequenties bekend:
- Promotor (RNA-polymerase, TATA-box binding protein (TBP))
- Enhancer (activators)
- Silencer (repressor)
Hoe beïnvloeden distale sequenties transcriptie? Zuivering van transcriptiefactor: Sp1: specificity
factor. Dit bindt aan de GC-box en stimuleert dus genen met een GC-box. Sp1 heeft 3 zink-vingers
(bestaande uit cysteïne (zwavel heeft vrij elektronenpaar) en histidine (heeft ook vrij
elektronenpaar)). Daarnaast heeft Sp1 een glutamine (Q)-rijk domein. (Glutamaat heeft een OH-
groep i.p.v. een NH2 groep). Mutanten van dit glutamine domein binden wel, maar stimuleren
transcriptie niet. Daarom wordt het ook wel een transactivatie domein genoemd. Sp1 is nodig voor
een toename van transcriptie en is gen-afhankelijk. De rol van Sp1 is dus een activator.
Bindt Sp1 aan basale factoren, zoals TBP? Nee, gezuiverd TBP bindt gen Sp1. Sp1 is een dimeer en
bindt dus 2 GC-boxen. Binding van TBP (monomeer) induceert een buiging van DNA.
- Activators binden aan enhancers, ze bepalen welke genen geactiveerd worden, bepalen de
efficiëntie van transcriptie.
- Repressors binden aan een geselecteerde sets van genen op silencers, en interfereren met
activators, inhiberen transcriptie
- Co-activators zijn adapter moleculen die signalen integreren van activators (en repressors) en
geven de signalen door aan de basale machinerie
- Basale activators positioneren RNA-polymerase op de promotor als reactie op activator
functie.
Fouten plaatje: RNA begint niet met een coderend gebied, maar met de start van transcriptie. Basale
activators moet general transcriptiefactoren/activators zijn.
Samenvatting: basale factoren: TBP. Co-activators of mediators of TAF’s, TBP-geassocieerde factoren.
Tijdens transcriptie: 5’-capping, splicing, 3’-poly-adenylering. mRNA heeft een open reading frame
(ORF) dat begint met AUG en eindigt met een stopcodon. Aan de 5’ kant zit een 5’UTR en aan de 3’
kant een 3’UTR (hier binden de miRNA’s, het is belangrijk voor stabiliteit en lokalisatie).
Initiatie van translatie begint met de 40S subunit van het ribosoom (small ribosomal unit) waaraan
initiator tRNA gebonden is. Het mRNA heeft dan al eiwitten gevonden, zoals het CBP (cap-binding
protein), eIF-4E bindt aan de 5’ cap en eIF-4G bindt daar weer aan. Translatie gebeurt ook in een
loop. Aan dit eiwitcomplex kan dan het ribosoom binden. Initiator tRNA beweegt langs het RNA op
zoek naar de eerste AUG, waarna ook het 60S ribosoom deel bindt. eIF-2 en andere initiatie factoren
dissociëren na een startcodon.
1
,Genetische therapieën:
1. Antisense therapie blokkeert translatie
2. Triplex-strategie blokkeert transcriptie
3. Gentherapie
4. RNAi
5. Gen reparatie
a. Oligonucleotide
b. Via zinc-finger-induced cleavage
c. TALENS
d. CRISPR-CAS9
Toetsvraag: Wat is het therapeutische molecuul bij antisense therapie? Geef details omtrent dit
molecuul. Een oligo van 16-20 nucleotiden, bijvoorbeeld S/thio-oligo, een morpholino (wat is dat, hoe
ziet het eruit). Dus modificaties noemen en waarvoor ze nodig zijn.
Een triplex vorming drug: stukje DNA/RNA dat bindt aan DNA, waardoor transcriptie geblokkeerd
wordt. Antisense drug is gericht tegen mRNA in het cytosol/de kern om translatie te blokkeren.
Structuur van een oligonucleotide:
- DNA-oligonucleotides = oligomeer = oligo ongeveer 16-20 nt, genoeg om een unieke plek in
genoom te vinden
- Base-afhankelijke binding, specifiek
- Sense & antisense
- Antisense oligo (ASO)
- DNases, RNases
- S- or thio-oligo (betere opname, minder negatief geladen, stabieler)
- 2’-O-methoxyethyl/DNA gapmer DNA-nucleotiden geflankeerd door een ongebruikelijke
ribose suiker, nog minder geladen, betere opname en minder afbraak.
- Morpholino, 5-ring is 6-ring, stikstof in ring, zuurstof van fosfaat is stikstof stabieler, DNase
resistenter, hydrofober dus makkelijkere opname. Een antisense morpholino is efficiënter in
gebieden voor de AUG, daarna neemt efficiëntie af. Dit is ook het moment dat de 60S
ribosoom deel bindt. De scanning van het 40S ribosoom kan dus geblokkeerd worden door
het morpholino, maar het hele ribosoom zou het morpholino van het mRNA af werpen.
o Voordelen: stabiliteit, DNAse resistent, opname beter, hydrofober
o Nadeel: kosten
Fout plaatje (34): fosfaat hoort niet bij die nucleotide.
Structuur van een triplex molecuul maakt een 3-DNA strengen structuur door H-bruggen te vormen
met het DNA. Dit is alleen stabiel als er AT-reeksen zijn is er niet in de praktijk. Er is dus een
sequentieprobleem.
Antisense oligo kan ribosoom blokkeren, zowel tijdens scanning als in het ORF. Wanneer een RNA-
DNA-hybride wordt gevormd, zorgt ribonuclease H voor het knippen van het mRNA. Bij RNAi wordt
ook mRNA geknipt. Vaak zijn sense strengen verontreinigd met antisense strengen waardoor alsnog
remming plaatsvindt.
Antisense tegen p53? P53 is een tumor suppressor, maar werd ook wel gezien als een proto-oncogen
omdat de mutante versie ervan tumor vorming stimuleert. Antisense tegen c-myc transcriptiefactor
zorgt voor vermindering van leukemie in muizen.
2
, Gentherapie:
- ADA-SCID
- Virussen als voertuig
- X-SCID
Gentherapie is menselijk-geïnduceerde veranderingen in het genotype. De genetische correctie van
een mutant, ziekte-veroorzakend genotype. Ashanti DeSilva was de eerst persoon die gentherapie
ontving.
Toetsvraag: wat is het therapeutisch molecuul bij gentherapie? Geef details. Ze is behandeld met een
retrovirus vector, die een expressie cassette bevat (cassette omschrijven met intron, psi, poly-A
signaal, ADA-gen, self-inactivating LTR).
Hematopoietische stamcel in beenmerg, hieruit groeien NK-cellen, B-cellen en T-cellen. Bij SCID is er
een blokkade die voorkomt dat NK-cellen en T-cellen (en indirect dus ook B-cellen) worden gevormd.
Dit komt door een mutatie in het enzym andenosine deaminase (ADA), wat nodig is bij de vorming
van inosine, een metaboliet in de purine synthese (nucleotiden).
- CLP: Common Lymphocyte Precursor
- HSC: Hematopoietische stamcel
ADA-SCID: adenosine-deaminase-severe combined immunodeficiency. Ashanti DeSilva was de eerste
die hier gentherapie voor ontving. Zij werd behandeld in 1990 retrovirus met ADA in volwassen T-
cellen, ondersteund door PEGylated (PEG)-ADA (polyethyleenglycol, zorgt voor langzame afgifte van
ADA want maakt ADA onoplosbaar).
HC 2 17-11-2017
Een virus wordt gebruikt als vector om humane cellen mee te behandelen, door directe injectie of
cellen afnemen en in vitro injecteren en de cellen terugplaatsen. Virussen zijn hier zeer geschikt voor,
omdat ze van nature cellen infecteren en zorgen dat ze eiwitten tot expressie brengen die ze normaal
niet produceren. Welke virussen/vectoren?
- Retrovirussen (10 kb) integreren genen in host chromosomen, bieden kans voor lange
termijn stabiliteit. Kan genen verstoren in het genoom (maar een klein deel van het genoom
bestaat uit exonen), alleen delende cellen worden geïnfecteerd (lentivirussen kunnen wel
niet-delende cellen infecteren).
- Adenovirussen (50 kb) veroorzaken meestal geen ernstige ziekten, grote capaciteit voor
vreemde genen. Genen kunnen tijdelijk functioneren, door geen integratie of aanval van
immuunsysteem.
- Adeno-geassocieerde virussen (AAV’s, 4,7 kb) integreren genen in host chromosomen,
veroorzaken geen humane ziekten. Kleine capaciteit voor vreemde genen. Heeft een helper-
virus nodig, AAV9 heeft brein tropisme (voorkeur voor hersencellen).
- Liposomen veroorzaken geen ziekte, minder efficiënt dan virussen bij gentransfer.
- ‘Naakt DNA’ veroorzaakt geen ziekte, makkelijk voor vaccinatie. Inefficiënte gentransfer,
instabiel in de meeste weefsels.
In het algemeen komen virussen niet het brein in BBB (bloed-brein-barrière).
Virussen bestaan uit een expressie cassette: 5’-promotor-intron-transgen-polyadenylatiesite-3’.
Genen komen efficiënter tot expressie wanneer ze een intron bevatten (‘The nuclear experience’).
Het intron zit in het ORF en niet voor het transgen.
3
