Samenvatting Hoofdstuk 11: 11.1 t/m 11.13
11.1 Restriction Enzymes and Nucleic Acids Separation
Genetische engineering is een techniek waarbij in vitro (in testbuizen) genen worden aangepast in
het laboratorium. In vivo is in levende organisme. Restrictie enzyme herkennen specifieke sequenties
en knipt de DNA om de cel te beschermen tegen ander DNA van een cel. Hij knipt niet in zijn eigen
DNA omdat hier een methylgroep is aangehangen door modificatie enzymen(methylases). Restrictie-
enzymen kunnen verdeeld worden in 3 klasse: I,II en III. I en III knippen verder dan de
herkenningssequentie. Type II wordt het meest gebruikt die meestal 4 tot 8 baseparen bevat. Als je
kijkt naar de verschillende strengen kun je zeggen dat het palindromen zijn.
Gelelektrofores is gebaseerd op de molecuulgrootte. Daarnaast gebruik je gelelektroforese om te
kijken of de amplificatie gelukt is. De moleculen worden gescheiden door een elektrisch veld (van de
– pool naar de + pool omdat DNA negatief is geladen) en op een agarosegel. Door ethidiumbromide
kan de DNA fragmenten fluoresceren onder UV licht.
11.2 Nucleic Acid Hybridization
Enkelstrengs DNA kan binden aan andere enkelstrengs DNA /RNA om segmenten DNA te kunnen
detecteren,karakteriseren en identificeren. Enkelstrengs DNA segmenten die bekend zijn heetten
nucleic acid probes. Deze kunnen ook radioactief gelabeld zijn.
Southern and Northern Blots
In Southern blotting probes met bekende sequenties worden gehybridiseerd aan DNA fragmenten
die zijn gescheiden door gelelektroforese. De hybridisatie procedure waarbij het DNA de
doelsequentie is wordt het Southern Blot genoemd. Eerst wordt het gedenatureerd en vervolgens
getransporteerd naar een synthetisch membraan. Denaturant zorgt ervoor dat er geen secundaire
structuren ontstaan. Daarna wordt het membraan blootgesteld aan een gelabeld probe. Wanneer
de probe complementair is dan bindt het.
Wanneer RNA de doelsequentie is wordt het Northern Blot genoemd. RNA moleculen worden
gescheiden en niet DNA moleculen. Het wordt gebruikt om mRNA te identificeren in specifieke
genen.
Hybridisatie wordt gebruikt om specifieke genen te detecteren in genomen die nog niet gesequenced
zijn. Een manier om dit te doen is door replica plating. Hierbij worden cellen gelyseerd op een
filter(om hun DNA te showen). De filter is behandeld om het DNA enkelstrengs te maken waarna er
een nucleinezuurprobe wordt toegevoegd. De niet gebonden probe wordt weggewassen waarna het
onder X-ray wordt gelegd en zo kun je zien waar de probe zich heeft gehecht aan de specifieke DNA.
Andere methode is Fluorensce InSitu Hybridization waarbij fluorescerende signalen de specifieke
DNA sequenties aankleuren.
11.3 Polymerase Chain Reaction
PCR kan segmenten DNA veelvuldig kopieren in een buisje, wat ook wel amplicatie wordt genoemd.
PCR gebruikt een enzym, DNA polymerase, om de fragmenten te kopieren. Synthesized
oligonucleotides primers (gemaakt van DNA) wordt gebruikt om het DNA te initiëren. Stappen van
amplificatie: De template wordt gedenatureerd 2. Twee primers hechtten aan het DNA molecuul 3.
DNA polymerase verlengt de primers door gebruik te maken van de orginele template. 4.
Temperatuur gaat omhoog zodat de DNA strengen weer denatureren en de proces herhaalt kan
worden.
11.1 Restriction Enzymes and Nucleic Acids Separation
Genetische engineering is een techniek waarbij in vitro (in testbuizen) genen worden aangepast in
het laboratorium. In vivo is in levende organisme. Restrictie enzyme herkennen specifieke sequenties
en knipt de DNA om de cel te beschermen tegen ander DNA van een cel. Hij knipt niet in zijn eigen
DNA omdat hier een methylgroep is aangehangen door modificatie enzymen(methylases). Restrictie-
enzymen kunnen verdeeld worden in 3 klasse: I,II en III. I en III knippen verder dan de
herkenningssequentie. Type II wordt het meest gebruikt die meestal 4 tot 8 baseparen bevat. Als je
kijkt naar de verschillende strengen kun je zeggen dat het palindromen zijn.
Gelelektrofores is gebaseerd op de molecuulgrootte. Daarnaast gebruik je gelelektroforese om te
kijken of de amplificatie gelukt is. De moleculen worden gescheiden door een elektrisch veld (van de
– pool naar de + pool omdat DNA negatief is geladen) en op een agarosegel. Door ethidiumbromide
kan de DNA fragmenten fluoresceren onder UV licht.
11.2 Nucleic Acid Hybridization
Enkelstrengs DNA kan binden aan andere enkelstrengs DNA /RNA om segmenten DNA te kunnen
detecteren,karakteriseren en identificeren. Enkelstrengs DNA segmenten die bekend zijn heetten
nucleic acid probes. Deze kunnen ook radioactief gelabeld zijn.
Southern and Northern Blots
In Southern blotting probes met bekende sequenties worden gehybridiseerd aan DNA fragmenten
die zijn gescheiden door gelelektroforese. De hybridisatie procedure waarbij het DNA de
doelsequentie is wordt het Southern Blot genoemd. Eerst wordt het gedenatureerd en vervolgens
getransporteerd naar een synthetisch membraan. Denaturant zorgt ervoor dat er geen secundaire
structuren ontstaan. Daarna wordt het membraan blootgesteld aan een gelabeld probe. Wanneer
de probe complementair is dan bindt het.
Wanneer RNA de doelsequentie is wordt het Northern Blot genoemd. RNA moleculen worden
gescheiden en niet DNA moleculen. Het wordt gebruikt om mRNA te identificeren in specifieke
genen.
Hybridisatie wordt gebruikt om specifieke genen te detecteren in genomen die nog niet gesequenced
zijn. Een manier om dit te doen is door replica plating. Hierbij worden cellen gelyseerd op een
filter(om hun DNA te showen). De filter is behandeld om het DNA enkelstrengs te maken waarna er
een nucleinezuurprobe wordt toegevoegd. De niet gebonden probe wordt weggewassen waarna het
onder X-ray wordt gelegd en zo kun je zien waar de probe zich heeft gehecht aan de specifieke DNA.
Andere methode is Fluorensce InSitu Hybridization waarbij fluorescerende signalen de specifieke
DNA sequenties aankleuren.
11.3 Polymerase Chain Reaction
PCR kan segmenten DNA veelvuldig kopieren in een buisje, wat ook wel amplicatie wordt genoemd.
PCR gebruikt een enzym, DNA polymerase, om de fragmenten te kopieren. Synthesized
oligonucleotides primers (gemaakt van DNA) wordt gebruikt om het DNA te initiëren. Stappen van
amplificatie: De template wordt gedenatureerd 2. Twee primers hechtten aan het DNA molecuul 3.
DNA polymerase verlengt de primers door gebruik te maken van de orginele template. 4.
Temperatuur gaat omhoog zodat de DNA strengen weer denatureren en de proces herhaalt kan
worden.
