Instrumentele: deel III:
chromatografische technieken
en principes
Hoofdstuk 1: algemeen theoretische
achtergrond
Chromatografie = techniek gebaseerd op scheiding 2/meer opgeloste substanties aanwezig in een
staal
mengsel (staal) in zijn samenstellende bestanddelen fractioneren (scheiden)
1 substantie uit mengsel isoleren
oplossing aanconcentreren
kwalitatieve + kwantitatieve analyse
Gebaseerd op verdeling opgeloste substanties tussen 2 fasen:
stilstaande stationaire fase
lopende mobiele fase
Vertraging op de stationaire fase indien er interactie is: vertraging moet ≠ zijn voor componenten
zodat ze met ≠ snelheid door kolom
vr chromatografische scheiding moeten substanties ≠ affiniteit voor 2 fasen (selectieve vertraging)
1. Kolomchromatografie
Stationaire fase geïmmobiliseerd in kolom: staal op top van kolom
aanbrengen, mobiele fase continu toevoegen
Staalcomponenten verdelen zich tussen 2 fasen en worden door
mobiele fase doorheen kolom gevoerd
Door selectieve vertraging op stationaire fase bewegen ze met ≠ snelheid (elueren) en worden gescheiden
1
,1.1. Types kolomchromatografie
Indeling in functie van ….
Type mobiele (gas/vl) en GLC, GSC, LSC, LLC
stationaire fase (vl/v)
Interactiemechanisme aan * Adsorptiechromatografie
basis van selectieve * Partitie- = verdelings-
vertraging (vnl deze wij) * Ionenuitwisselings- (ion exchange IEC)
* Gel- (size exclusion SEC)
* Affiniteits-
zie interactiemechanismen verder gezien: dit als soort
samenvattende figuren!!!
Manier van uitvoering Elutie, verdringings-, frontale-
2. Het scheidingsproces
Chromatografische kolom = statisch systeem in evenwicht
Substantie A is in evenwicht tussen mobiele M en stationaire fase S : A M ↔ AS
2
, Voorbeeld: 20% A in M, 80% A in S
A in de mobiele fase beweegt voort in incrementen maar blijft
hierbij in evenwicht met A in de stationaire fase
Het 20-80 evenwicht wordt namelijk hersteld doordat A in de
mobiele fase komt: doordat de mobiele fase voortbeweegt komt A
weer uit de stationaire fase om het evenwicht te herstellen
2.1. Beschrijving scheidingsproces
Evenwicht beschrijven door evenwichtsconstante K = molaire conc component in stationaire fase M s
gedeeld door molaire conc in mobiele fase MM = verdelings-/partitiecoëfficiënt
K = M S / MM
= (nS / VS) / (nM / VM) = (nS / nM) / (VM / VS)
K is componentspecifiek voor een bep chromatografisch systeem
Grote K = grotere conc in stationaire fase = veel interactie met stationaire fase = langere
verblijftijd in stationaire fase dus langer in kolom: tR
Kleine K = veel interactie met mobiele fase = sneller uit kolom
2.2. Visualisatie scheidingsproces
Detector meet een fysische eigenschap van de eluerende substanties
bijkomende voorwaarde = mobiele fase bezit deze fysische eigenschap niet/amper zodat er
geen/weinig signaal van de mobiele fase is, anders komt het detectiesignaal van de eluerende
substantie en de mobiele fase
Gemeten eigenschap elektrisch signaal chromatogram: signaal ifv tijd of volume
y-as: detectorrespons / signaal
x-as: retentietijd / volume
piek: signaal van component
3
, Piekkarakteristieken: moeten symmetrisch zijn + niet overlappen
VORM:
* Gaussiaans = symmetrisch
* Tailing = scheef naar rechts = right skew
= fractie component komt er meer vertraagd uit dan rest
* Leading = left skew = typisch bij te veel op kolom brengen:
dan is er onvoldoende interactie met stationaire fase: komt er versneld uit
KWANTIFICATIE: hoogte, oppervlakte
Tailing wordt beschreven adhv de asymmetriefactor: As = BC/CA
3. Retentie
Retentieparameters kan je afleiden uit chromatogram:
Klein signaal na aantal min = injectiesignaal want solvent waarin
componenten worden opgelost vertoont enkel interactie met
mobiele fase: loopt eruit
tM / VM = t0 / V0 Nul (hold up) tijd / volume
Tijd om doorheen kolom te migreren zonder enige interactie met de stationaire fase
tR / VR Brutoretentietijd / volume
Tijd tussen injectie en maximum detectorrespons
t’R / V’R Nettoretentietijd / volume
= t R - t M / V R - VM
4
chromatografische technieken
en principes
Hoofdstuk 1: algemeen theoretische
achtergrond
Chromatografie = techniek gebaseerd op scheiding 2/meer opgeloste substanties aanwezig in een
staal
mengsel (staal) in zijn samenstellende bestanddelen fractioneren (scheiden)
1 substantie uit mengsel isoleren
oplossing aanconcentreren
kwalitatieve + kwantitatieve analyse
Gebaseerd op verdeling opgeloste substanties tussen 2 fasen:
stilstaande stationaire fase
lopende mobiele fase
Vertraging op de stationaire fase indien er interactie is: vertraging moet ≠ zijn voor componenten
zodat ze met ≠ snelheid door kolom
vr chromatografische scheiding moeten substanties ≠ affiniteit voor 2 fasen (selectieve vertraging)
1. Kolomchromatografie
Stationaire fase geïmmobiliseerd in kolom: staal op top van kolom
aanbrengen, mobiele fase continu toevoegen
Staalcomponenten verdelen zich tussen 2 fasen en worden door
mobiele fase doorheen kolom gevoerd
Door selectieve vertraging op stationaire fase bewegen ze met ≠ snelheid (elueren) en worden gescheiden
1
,1.1. Types kolomchromatografie
Indeling in functie van ….
Type mobiele (gas/vl) en GLC, GSC, LSC, LLC
stationaire fase (vl/v)
Interactiemechanisme aan * Adsorptiechromatografie
basis van selectieve * Partitie- = verdelings-
vertraging (vnl deze wij) * Ionenuitwisselings- (ion exchange IEC)
* Gel- (size exclusion SEC)
* Affiniteits-
zie interactiemechanismen verder gezien: dit als soort
samenvattende figuren!!!
Manier van uitvoering Elutie, verdringings-, frontale-
2. Het scheidingsproces
Chromatografische kolom = statisch systeem in evenwicht
Substantie A is in evenwicht tussen mobiele M en stationaire fase S : A M ↔ AS
2
, Voorbeeld: 20% A in M, 80% A in S
A in de mobiele fase beweegt voort in incrementen maar blijft
hierbij in evenwicht met A in de stationaire fase
Het 20-80 evenwicht wordt namelijk hersteld doordat A in de
mobiele fase komt: doordat de mobiele fase voortbeweegt komt A
weer uit de stationaire fase om het evenwicht te herstellen
2.1. Beschrijving scheidingsproces
Evenwicht beschrijven door evenwichtsconstante K = molaire conc component in stationaire fase M s
gedeeld door molaire conc in mobiele fase MM = verdelings-/partitiecoëfficiënt
K = M S / MM
= (nS / VS) / (nM / VM) = (nS / nM) / (VM / VS)
K is componentspecifiek voor een bep chromatografisch systeem
Grote K = grotere conc in stationaire fase = veel interactie met stationaire fase = langere
verblijftijd in stationaire fase dus langer in kolom: tR
Kleine K = veel interactie met mobiele fase = sneller uit kolom
2.2. Visualisatie scheidingsproces
Detector meet een fysische eigenschap van de eluerende substanties
bijkomende voorwaarde = mobiele fase bezit deze fysische eigenschap niet/amper zodat er
geen/weinig signaal van de mobiele fase is, anders komt het detectiesignaal van de eluerende
substantie en de mobiele fase
Gemeten eigenschap elektrisch signaal chromatogram: signaal ifv tijd of volume
y-as: detectorrespons / signaal
x-as: retentietijd / volume
piek: signaal van component
3
, Piekkarakteristieken: moeten symmetrisch zijn + niet overlappen
VORM:
* Gaussiaans = symmetrisch
* Tailing = scheef naar rechts = right skew
= fractie component komt er meer vertraagd uit dan rest
* Leading = left skew = typisch bij te veel op kolom brengen:
dan is er onvoldoende interactie met stationaire fase: komt er versneld uit
KWANTIFICATIE: hoogte, oppervlakte
Tailing wordt beschreven adhv de asymmetriefactor: As = BC/CA
3. Retentie
Retentieparameters kan je afleiden uit chromatogram:
Klein signaal na aantal min = injectiesignaal want solvent waarin
componenten worden opgelost vertoont enkel interactie met
mobiele fase: loopt eruit
tM / VM = t0 / V0 Nul (hold up) tijd / volume
Tijd om doorheen kolom te migreren zonder enige interactie met de stationaire fase
tR / VR Brutoretentietijd / volume
Tijd tussen injectie en maximum detectorrespons
t’R / V’R Nettoretentietijd / volume
= t R - t M / V R - VM
4
