HOOFDSTUK 1: INLEIDING
GESCHIEDENIS
Ruim 100j geleden werd voor het eerst kikkerweefsel geïsoleerd.
Gebruik gemaakt van koudbloedig organisme omdat er in die tijd geen incubatoren bestonden.
Door gebruik van koudbloedig organisme, kon het weefsel op kamertemperatuur in leven blijven.
Doorbraak rond jaren ‘50
- Antibiotica
o Belangrijk om cellen steriel buiten lichaam in het labo te kunnen kweken
- Trypsine (= enzym, protease dat in staat is eiwitten af te breken)
o Nodig om van weefsel naar afzonderlijke cellen te kunnen gaan
- Chemisch gedefinieerde cultuurmedia (water, suiker, vitamines…)
Exponentiële toename na 1970
WAARVOOR KUNNEN CELCULTUREN GEBRUIKT WORDEN?
POLIO
= RNA virus & naakt virus (zonder enveloppe) dat kind verlamming veroorzaakt.
Virus bevat steeds soort van capside die eiwitten bevat, daarnaast soms ook enveloppe.
Polio is obligaat intracellulair: heeft een cel nodig voor groei.
Virus kan enkel groeien in een cel, een bacterie kan wel at random groeien (in bv water).
Virus beschikt over spikes (= glycoproteïnen nodig om op receptoren te binden)
Bij virussen met enveloppe bevinden de spikes zich op de enveloppe
× Begin jaren 50 werd poliovirus voor het eerst gekweekt in embryonale cellen
× 1953: Ontwikkeling van een Formaline geïnactiveerd poliovaccin
Formaline (=formaldehyde) heeft als eigenschap de structuur van het virus te behouden, zodat het
immuunsysteem (IS) goed kan reageren, ondanks dat organisme (virus) dood gemaakt (geïnactiveerd) wordt.
× 1957: ontwikkeling levend verzwakt poliovaccin
Virus zo aanpassen (overbrengen van fles naar fles) aan
labo omgeving (gunstige omstandigheden) dat het enkel
kan groeien in celcultuur (gewoonwording), maar niet
meer kan groeien in het menselijk/dierlijk lichaam
(ongunstige omstandigheden)
Overbrengen van fles naar fles = subcultivatie = passage
1
,HELA CELLEN
Meest gekende cellen in de oncologie (kankerkunde)
Henrietta Lacks had baarmoederhalskanker à cellen weggenomen en gekweekt in labo.
Cellen veelvuldig gebruikt in onderzoek naar kankers, ontstaan ervan, mogelijke therapie enz.
HYBRIDOMA-TECHNOLOGIE
= methode om grote aantallen monoklonale (identieke) antilichamen (Ab) te produceren, die zouden inwerken
tegen 1 bepaald antigen (Ag)
Na injectie van een Ag in een muis werden B-cellen vd muis geïsoleerd. Deze B-cellen zijn producenten van Ab.
Het probleem was dat B-cellen een eindige levensduur hebben.
Men ging dus een Ab producerende cel laten fusioneren met een tumorcel (wel oneindige levensduur).
Þ Zo ontstond een hybridoma.
= B- cel die eeuwig groeien en dus oneindig het Ab kunnen produceren
De fusie van B-cel en tumorcel gebeurt echter niet spontaan: polyethyleenglycol (PEG) gebruikt
Maakt hybridoma wel juiste Ab?
Wanneer je op plaat gevuld met Ag de hybridomas aanbrengt, zullen enkel diegene met het juiste Ab binden.
Zo heb je selectie van juiste hybridomacel die juiste Ab aanmaakt.
Zo verkrijg je monoklonaal expansie want ééntje die juiste antilichaam aanmaakt wordt gekweekt.
CEL- EN WEEFSELTECHNOLOGIE
× Implantaten: nabootsen van menselijk weefsel/organen vanuit stamcellenonderzoek
× Skingrafting: brandwonden, diabetesvoet
à Diabetespatiënten: last van zeer traag helende wonden. Wanneer deze geïnfecteerd geraken kan de infectie
mogelijks in de bloedbaan geraken, wat zal leiden tot het in shock gaan van de patiënt. Infectie kan zo ver gaan
dat amputaties de enige uitweg zijn.
à Men werkt met een polymeer waarop cellen (fibroblasten) gekweekt kunnen worden. Deze polymeer wordt
aangebracht op de wonde, wat ervoor zorgt dat deze minder vatbaar is voor infecties en na 4-tal weken zal de
wonde genezen zijn.
Diabetes type I (zie slide 16: goede figuur): Een patiënt maakt onvoldoende insuline aan.
Bij een pancreastransplantatie sterft 80% van de cellen af à op zoek naar andere oplossing.
In de eilandjes van Langerhans wordt insuline geproduceerd. Men plaatst de eilandjes in soort van scaffold met
daarboven hydrogel die groeifactoren bevat. De groeifactoren zorgen voor een optimaal milieu zodat de
eilandjes lang kunnen blijven produceren. De volledige scaffold transplanteerd men nabij (in) bloedbaan
Þ Cellen kunnen dan insuline aanmaken die in bloedbaan terecht komt en zorgt dat suiker opgenomen wordt.
2
,VOORDELEN
1) Controle van de omgeving
× Fysiochemische parameters
o pH (ideaal: pH 7,2)
o Temperatuur (temperatuur tss 36-38 (liever 36 dan 38))
o Osmotische druk. (isotoon (niet hyper- of hypotoon))
o O2 (21%)
o CO2 (0,03%)
× Fysiologische parameters: voedingsstoffen (+ % serum)
2) Karakterisatie en homogeniteit
× ‘Redelijk’ homogeen: verschillende soorten celtypes groeien beter/slechter dan anderen
× Na # passages (overbrengen cellen in andere cultuurfles): cellen minder goed delen/afsterven
o Cryo stok: deel cellen collecteren en bewaren in vloeibare stikstof.
o Ingevroren cellen kunnen gebruikt worden wanneer originele normale cellen na #
passages minder goed groeien/afsterven
3) Kostprijs (versus proefdierexperimenten)
× Miniaturisatie: kleine hoeveelheden monster en reagentia
× Proefdierexperimenten zijn veel prijziger
4) Ethiek: werken met geïsoleerde weefsels of individuele cellen in ethisch opzicht beter dan proefdieren
BEPERKINGEN
1) Zekere expertise vereist
× Aseptisch werken (grote kans op infecties in cultuurfles) à vergt nauwkeurigheid
× Cellen vertonen tragere groei dan meeste bacteriën en schimmels
2) Hoeveelheid
× Op laboschaal: kan er maximum een 109 cellen (1 gram) in een fles gekweekt worden
× Industriële schaal vereist upscaling (wat vaak leidt tot problemen)
3) Instabiliteit
× Normale cellen: beperkte levensduur à na verloop v tijd moeilijker delen/afsterven (senescentie)
4) Cultuuromgeving versus in vivo
× Tweedimensionaal (in vivo: driedimensionaal)
o Cel-cel en cel-matrix interacties
o “Cellen zijn beweeglijk”
o Snelle celdeling
o Eén of twee celtypes blijven over
× Over simplificatie van het cultuurmedium
o Zenuwstelsel en endocriene organen ontbreken (gn neurotransmitters, bep. hormonen)
3
, × Cellulair metabolisme is meer constant
o Groeimedium beschikt over veel meer suikers die zorgen voor snelle groei en die cellen
aanzetten tot glycolyse en veel ATP-productie. In vivo zijn cellen veel meer aangewezen
op de citroenzuurcyclus
EX: Geef de voordelen of beperkingen van werken met celculturen. Haal hierbij een voorbeeld aan, …
HOOFDSTUK 2: CEL- EN WEEFSELCULTUREN: DEFINITIES
ORGAANCULTUREN WEEFSELNIVEAU
Stukje van orgaan wordt onderzocht.
Vb. Bloedvat placenta
Binnenzijde BV: endotheelcellen en gladde spiercellen à moeilijk te kweken in cultuurfles
à Gebruik maken van bloedvat placenta die je brengt in een cupje (opening in een plaat)
De tumorale cellen eisen voedingsstoffen voor hun groei, en willen hiervoor BV aanmaken (angiogenese).
Hiervoor zullen de tumorcellen groeifactoren aanmaken, die op hun beurt angiogene eiwitten produceren en
dus angiogenese induceren.
Model waar BV worden aangemaakt en stoffen met anti angiogenese
Op LM-beeld (slide 21) zie je grote bloedvat en de uitgaande kleine bloedvaatjes = angiogenese
4
GESCHIEDENIS
Ruim 100j geleden werd voor het eerst kikkerweefsel geïsoleerd.
Gebruik gemaakt van koudbloedig organisme omdat er in die tijd geen incubatoren bestonden.
Door gebruik van koudbloedig organisme, kon het weefsel op kamertemperatuur in leven blijven.
Doorbraak rond jaren ‘50
- Antibiotica
o Belangrijk om cellen steriel buiten lichaam in het labo te kunnen kweken
- Trypsine (= enzym, protease dat in staat is eiwitten af te breken)
o Nodig om van weefsel naar afzonderlijke cellen te kunnen gaan
- Chemisch gedefinieerde cultuurmedia (water, suiker, vitamines…)
Exponentiële toename na 1970
WAARVOOR KUNNEN CELCULTUREN GEBRUIKT WORDEN?
POLIO
= RNA virus & naakt virus (zonder enveloppe) dat kind verlamming veroorzaakt.
Virus bevat steeds soort van capside die eiwitten bevat, daarnaast soms ook enveloppe.
Polio is obligaat intracellulair: heeft een cel nodig voor groei.
Virus kan enkel groeien in een cel, een bacterie kan wel at random groeien (in bv water).
Virus beschikt over spikes (= glycoproteïnen nodig om op receptoren te binden)
Bij virussen met enveloppe bevinden de spikes zich op de enveloppe
× Begin jaren 50 werd poliovirus voor het eerst gekweekt in embryonale cellen
× 1953: Ontwikkeling van een Formaline geïnactiveerd poliovaccin
Formaline (=formaldehyde) heeft als eigenschap de structuur van het virus te behouden, zodat het
immuunsysteem (IS) goed kan reageren, ondanks dat organisme (virus) dood gemaakt (geïnactiveerd) wordt.
× 1957: ontwikkeling levend verzwakt poliovaccin
Virus zo aanpassen (overbrengen van fles naar fles) aan
labo omgeving (gunstige omstandigheden) dat het enkel
kan groeien in celcultuur (gewoonwording), maar niet
meer kan groeien in het menselijk/dierlijk lichaam
(ongunstige omstandigheden)
Overbrengen van fles naar fles = subcultivatie = passage
1
,HELA CELLEN
Meest gekende cellen in de oncologie (kankerkunde)
Henrietta Lacks had baarmoederhalskanker à cellen weggenomen en gekweekt in labo.
Cellen veelvuldig gebruikt in onderzoek naar kankers, ontstaan ervan, mogelijke therapie enz.
HYBRIDOMA-TECHNOLOGIE
= methode om grote aantallen monoklonale (identieke) antilichamen (Ab) te produceren, die zouden inwerken
tegen 1 bepaald antigen (Ag)
Na injectie van een Ag in een muis werden B-cellen vd muis geïsoleerd. Deze B-cellen zijn producenten van Ab.
Het probleem was dat B-cellen een eindige levensduur hebben.
Men ging dus een Ab producerende cel laten fusioneren met een tumorcel (wel oneindige levensduur).
Þ Zo ontstond een hybridoma.
= B- cel die eeuwig groeien en dus oneindig het Ab kunnen produceren
De fusie van B-cel en tumorcel gebeurt echter niet spontaan: polyethyleenglycol (PEG) gebruikt
Maakt hybridoma wel juiste Ab?
Wanneer je op plaat gevuld met Ag de hybridomas aanbrengt, zullen enkel diegene met het juiste Ab binden.
Zo heb je selectie van juiste hybridomacel die juiste Ab aanmaakt.
Zo verkrijg je monoklonaal expansie want ééntje die juiste antilichaam aanmaakt wordt gekweekt.
CEL- EN WEEFSELTECHNOLOGIE
× Implantaten: nabootsen van menselijk weefsel/organen vanuit stamcellenonderzoek
× Skingrafting: brandwonden, diabetesvoet
à Diabetespatiënten: last van zeer traag helende wonden. Wanneer deze geïnfecteerd geraken kan de infectie
mogelijks in de bloedbaan geraken, wat zal leiden tot het in shock gaan van de patiënt. Infectie kan zo ver gaan
dat amputaties de enige uitweg zijn.
à Men werkt met een polymeer waarop cellen (fibroblasten) gekweekt kunnen worden. Deze polymeer wordt
aangebracht op de wonde, wat ervoor zorgt dat deze minder vatbaar is voor infecties en na 4-tal weken zal de
wonde genezen zijn.
Diabetes type I (zie slide 16: goede figuur): Een patiënt maakt onvoldoende insuline aan.
Bij een pancreastransplantatie sterft 80% van de cellen af à op zoek naar andere oplossing.
In de eilandjes van Langerhans wordt insuline geproduceerd. Men plaatst de eilandjes in soort van scaffold met
daarboven hydrogel die groeifactoren bevat. De groeifactoren zorgen voor een optimaal milieu zodat de
eilandjes lang kunnen blijven produceren. De volledige scaffold transplanteerd men nabij (in) bloedbaan
Þ Cellen kunnen dan insuline aanmaken die in bloedbaan terecht komt en zorgt dat suiker opgenomen wordt.
2
,VOORDELEN
1) Controle van de omgeving
× Fysiochemische parameters
o pH (ideaal: pH 7,2)
o Temperatuur (temperatuur tss 36-38 (liever 36 dan 38))
o Osmotische druk. (isotoon (niet hyper- of hypotoon))
o O2 (21%)
o CO2 (0,03%)
× Fysiologische parameters: voedingsstoffen (+ % serum)
2) Karakterisatie en homogeniteit
× ‘Redelijk’ homogeen: verschillende soorten celtypes groeien beter/slechter dan anderen
× Na # passages (overbrengen cellen in andere cultuurfles): cellen minder goed delen/afsterven
o Cryo stok: deel cellen collecteren en bewaren in vloeibare stikstof.
o Ingevroren cellen kunnen gebruikt worden wanneer originele normale cellen na #
passages minder goed groeien/afsterven
3) Kostprijs (versus proefdierexperimenten)
× Miniaturisatie: kleine hoeveelheden monster en reagentia
× Proefdierexperimenten zijn veel prijziger
4) Ethiek: werken met geïsoleerde weefsels of individuele cellen in ethisch opzicht beter dan proefdieren
BEPERKINGEN
1) Zekere expertise vereist
× Aseptisch werken (grote kans op infecties in cultuurfles) à vergt nauwkeurigheid
× Cellen vertonen tragere groei dan meeste bacteriën en schimmels
2) Hoeveelheid
× Op laboschaal: kan er maximum een 109 cellen (1 gram) in een fles gekweekt worden
× Industriële schaal vereist upscaling (wat vaak leidt tot problemen)
3) Instabiliteit
× Normale cellen: beperkte levensduur à na verloop v tijd moeilijker delen/afsterven (senescentie)
4) Cultuuromgeving versus in vivo
× Tweedimensionaal (in vivo: driedimensionaal)
o Cel-cel en cel-matrix interacties
o “Cellen zijn beweeglijk”
o Snelle celdeling
o Eén of twee celtypes blijven over
× Over simplificatie van het cultuurmedium
o Zenuwstelsel en endocriene organen ontbreken (gn neurotransmitters, bep. hormonen)
3
, × Cellulair metabolisme is meer constant
o Groeimedium beschikt over veel meer suikers die zorgen voor snelle groei en die cellen
aanzetten tot glycolyse en veel ATP-productie. In vivo zijn cellen veel meer aangewezen
op de citroenzuurcyclus
EX: Geef de voordelen of beperkingen van werken met celculturen. Haal hierbij een voorbeeld aan, …
HOOFDSTUK 2: CEL- EN WEEFSELCULTUREN: DEFINITIES
ORGAANCULTUREN WEEFSELNIVEAU
Stukje van orgaan wordt onderzocht.
Vb. Bloedvat placenta
Binnenzijde BV: endotheelcellen en gladde spiercellen à moeilijk te kweken in cultuurfles
à Gebruik maken van bloedvat placenta die je brengt in een cupje (opening in een plaat)
De tumorale cellen eisen voedingsstoffen voor hun groei, en willen hiervoor BV aanmaken (angiogenese).
Hiervoor zullen de tumorcellen groeifactoren aanmaken, die op hun beurt angiogene eiwitten produceren en
dus angiogenese induceren.
Model waar BV worden aangemaakt en stoffen met anti angiogenese
Op LM-beeld (slide 21) zie je grote bloedvat en de uitgaande kleine bloedvaatjes = angiogenese
4
