FLOW CYTOMETRY
Links: dot plot. Ieder puntje stelt 1 cel voor die
gegamalyseerd wordt. Waarde wordt bepaald door licht. Je
kijkt niet naar fluorsescentie van cel zelf maar cel die
antistof bindt en fluoresecend gemerkt wordt of cel die
niet fluoresecent gemerkt wordt. Bepaalde stof gebonden
dus merker op oppervlak dus gebonden.
Je kijkt naar 2 merkers tegelijkertijd. Het is logaritmische
opgebouwd
Y as is sidescatter en x as is fluocroom (zie verder)
Rechts: histogram. Je wilt bv kijken of cellen CD positief zijn. Je ziet dan alle cellen die positief zijn. Je voegt altijd een negatieve
controle toe, meestal weergegeven aan linker kant als blauw lijntje.
Flow cytometer: in het toestel heb je een lichtbron (UV licht om fluocromen te activeren), detectoren (meten als cel voorbij
komt, welke energie die cel uitstraalt), cellen in suspensie bekijken (cellen die rondrijven die we kunnen opzuigen)
Als die cellen worden opgezogen is dat eerst een brede buis, alle cellen zitten bij
elkaar. Je wilt alle cellen na elkaar in single flow terechtkomen. Dat is cruciaal want je wilt
alle cellen 1 voor 1 analyseren. Voordeel als alle cellen apart zijn dat je ze 1 voor 1 kan
bestralen met licht.
Fluidics system:
Voordeel als alle cellen apart zijn dat je ze 1
voor 1 kan bestralen met licht .
Detectoren kunnen zichtbaarlicht detecteren
1. forwardscatter. Als cel door
lichtbundel voorbij komt meet de
detector de reductie in licht
densiteit
2. Sitescatter: licht dat verstrooid
wordt loodrecht op lichtbron meten,
als er geen verstrooiing is is de ssc 0.
Als er cel voorbij komt is er licht
verstrooiing. Licht verstrooiing is
afhankelijk van granules, zijn allemaal kleine lensjes die zorgen voor licht verstrooiing
Forward scatter FSC: licht dat tegengehouden wordt
, SSC: verstrooiing dat we krijgen
Dot plot (multiparametric)
Rechts boven: granulocyten
Midden gemengde populatie met
meeste immuuncellen: monocyten,
macrofagen . Niet meer te
onderscheiden met side en forward
scatter
Links: debries, kapotte cellen
Fluorescence (FL)
Elke antistof gebonden met specifiek fluocroom
De 2 scatters laten toch wel een onderscheid toe tussen moocyten,
lymfocyten, granulocyten
Links: je hebt populatie cellen en je test die voor bepaalde
merker. Als het dier niet geïnfecteerd of gevaccineerd is laat die
merker niet tot expresssie. Grootste deel van populatie zit links,
beschouw je als negatief, maar een klein deel van de cellen is
positief.
Toepassing praktijk: forward en site scatter cd4 en cd8
CD4 als merker: t helpercel
Links: dot plot. Ieder puntje stelt 1 cel voor die
gegamalyseerd wordt. Waarde wordt bepaald door licht. Je
kijkt niet naar fluorsescentie van cel zelf maar cel die
antistof bindt en fluoresecend gemerkt wordt of cel die
niet fluoresecent gemerkt wordt. Bepaalde stof gebonden
dus merker op oppervlak dus gebonden.
Je kijkt naar 2 merkers tegelijkertijd. Het is logaritmische
opgebouwd
Y as is sidescatter en x as is fluocroom (zie verder)
Rechts: histogram. Je wilt bv kijken of cellen CD positief zijn. Je ziet dan alle cellen die positief zijn. Je voegt altijd een negatieve
controle toe, meestal weergegeven aan linker kant als blauw lijntje.
Flow cytometer: in het toestel heb je een lichtbron (UV licht om fluocromen te activeren), detectoren (meten als cel voorbij
komt, welke energie die cel uitstraalt), cellen in suspensie bekijken (cellen die rondrijven die we kunnen opzuigen)
Als die cellen worden opgezogen is dat eerst een brede buis, alle cellen zitten bij
elkaar. Je wilt alle cellen na elkaar in single flow terechtkomen. Dat is cruciaal want je wilt
alle cellen 1 voor 1 analyseren. Voordeel als alle cellen apart zijn dat je ze 1 voor 1 kan
bestralen met licht.
Fluidics system:
Voordeel als alle cellen apart zijn dat je ze 1
voor 1 kan bestralen met licht .
Detectoren kunnen zichtbaarlicht detecteren
1. forwardscatter. Als cel door
lichtbundel voorbij komt meet de
detector de reductie in licht
densiteit
2. Sitescatter: licht dat verstrooid
wordt loodrecht op lichtbron meten,
als er geen verstrooiing is is de ssc 0.
Als er cel voorbij komt is er licht
verstrooiing. Licht verstrooiing is
afhankelijk van granules, zijn allemaal kleine lensjes die zorgen voor licht verstrooiing
Forward scatter FSC: licht dat tegengehouden wordt
, SSC: verstrooiing dat we krijgen
Dot plot (multiparametric)
Rechts boven: granulocyten
Midden gemengde populatie met
meeste immuuncellen: monocyten,
macrofagen . Niet meer te
onderscheiden met side en forward
scatter
Links: debries, kapotte cellen
Fluorescence (FL)
Elke antistof gebonden met specifiek fluocroom
De 2 scatters laten toch wel een onderscheid toe tussen moocyten,
lymfocyten, granulocyten
Links: je hebt populatie cellen en je test die voor bepaalde
merker. Als het dier niet geïnfecteerd of gevaccineerd is laat die
merker niet tot expresssie. Grootste deel van populatie zit links,
beschouw je als negatief, maar een klein deel van de cellen is
positief.
Toepassing praktijk: forward en site scatter cd4 en cd8
CD4 als merker: t helpercel
