Histologie Methoden (microscopische technieken) 1e Ba BMW
0. Leerdoelen
× Lichtmicroscopische technieken kennen
× Elektronenmicroscopische technieken kennen (geavanceerde microscopie in Ba3)
× Beelden van coupes en microscopische technieken koppelen
× Verschillen tussen LM en EM preparatietechnieken verklaren
× Bewust worden van grootteverschillen in cellen en weefsels en het bereik van de
gehanteerde microscopische technieken
1. Inleiding
Grootte van enkele basiscellen:
× RBC: 6 µ𝑚
× Eicel – Follikel: < 100 µ𝑚
× Skeletspiercel (-vezel): Enkele mm tot tientallen cm’s
× Diameter mitochondrion: 0,2 µ𝑚
“Microscopie” afkomstig vh Griekse “mikros” (klein) en “skopeo” (kijken naar) betekent.
Microscoop moet 3 (F) vervullen:
1) Vergroting: Vergroot beeld van het specimen produceren
2) Resolutie: Details in het beeld scheiden
3) Contrast: Details zichtbaar maken voor het menselijk oog, een camera of een ander
waarnemingsapparaat/beeldopname-apparaat
Oog LM TEM
Vergroting 1000x 450.000 x
Resolutie 0,1 - 0,2 m𝑚 0,2 µ𝑚 0,1 n𝑚
Verschillende types van microscopen worden gebruikt in tal van situaties:
× Stellen van klinische diagnoses
× Structuren visualiseren voor onderwijs- of onderzoeksdoeleinden
× …
2. Resolutie en numerieke apertuur
Resolutie (scheidend- of oplossend vermogen): Vermogen v/e microscoop om 2 punten op coupe als
afzonderlijk te kunnen waarnemen. (voor beste microscopen bij optimale instelling 0,2µm)
!
𝑑= "# $%& '
(d = kleinst mogelijke afstand en 𝛼 = µ)
𝑁𝐴 = 𝑛 . 𝑠𝑖𝑛 µ
× 𝑛 = brekingsindex vh medium tss objectief & preparaat (max: 1)
× µ = halve tophoek van de apertuurkegel.
Droge objectieven (medium = lucht): NA steeds kleiner zijn dan 1.
Olie-immersielenzen: maximale NA ongeveer 1.4
Water-immersie lenzen: maximale NA 1.2.
1
, Histologie Methoden (microscopische technieken) 1e Ba BMW
Formule voor de resolutie v/e microscoop is: 𝑅 = 𝜆 /𝑁𝐴
× 𝜆 = golflengte van de belichting
× 𝑁𝐴 = numerieke apertuur van de objectieflens. (=kwaliteitswaardemeter voor het objectief)
Uit vergelijking kan een # zaken aflgeleid worden:
× Hoe hoger de NA, hoe beter de resolutie zal zijn want R zal kleiner worden.
× Hoe korter de golflengte (𝜆), hoe beter de resolutie wordt.
Þ Hoge (goede) 𝑅 bekomen als 𝑁𝐴 zo hoog mogelijk & 𝜆 vd belichting zo kort mogelijk houdt.
Belichtingssysteem moet altijd zo ingesteld staan dat een maximale helderheid bekomen wordt.
Lagere belichtingsintensiteit heeft lagere resolutie tot gevolg.
Toch spelen er andere factoren mee die remmend werken op onbeperkte vergrotingen. Indien dit
niet was: mogelijk om vergrotingen te bekomen die 1000x groter zijn dan specimen zelf
Breking van het licht is golflengte afhangkelijk!
Lensfouten
× Chromatische abberatie: elke kleur eigen brandpuntsafstand – appochromatische lenzen
× Sferische abberatie: brandpuntsafspand hangt af van afstand van invallende straal tov
optische as – PLAN-gecorrigeerde lenzen
× Astigmatisme: stralen in een vlak door de optische as hebben een andere brandpuntsafstand
dan stralen in een vlak dat niet door het midden van de lens gaat.
3. Voorbereiding van een preparaat voor conventionele lichtmicroscopie
× Uitstrijkje van cellen in suspensie (bloed) – Weefselsneden (coupes)
Werkwijze: FIXATIE – INBEDDING – SNIJDEN EN OPVANGEN - KLEUREN
1) Het te onderzoeken orgaan of weefsel uit dier verwijderen
2) Fixeren door: perfusie (via bloedbaan), immersie (onderdompelen: in bv formaldehyde) of
door chemische verbindingen “cross linking” (tuusen fixatief en de in het weefsel aanwezige
biomoleculen)
× Noodzakelijk om degradatie van weeefsel door bacteriën en enzymen tegen te gaan
× Door fixatie blijft (ultra)structuur van het weefsel bewaard
3) Gefixeerde weefsel spoelen, daarna dehydrateren (in baden met oplopende [ ] van ethanol),
daarna ingebed in paraffine (probleem: paraffine is waterafstotend)
4) Weefselblokje (omgeven dr paraffine) in houder microtoom geplaatst (snijdt dunne coupes)
5) Coupe (2 tot 7 µ𝑚 dik) opgevangen op draagglaasje en gedeparaffineerd d.m.v. xyleen
Overlangse, dwarse, en schuine doorsneden
6) Via omgekeerde alcoholreeks weefsel opnieuw in waterig milieu brengen om voor kleuring
× Kleuring = noodzakelijk. Ongekleurd weefsel ong zelfde brekingsindex als glas ® in gewone
LM met doorvallend licht weinig zichtbaar. Kleur zorgt vr differentiatie van versch structuren
× HE-kleuring: Hematoxyline: basische kleurstof (zure affiniteit). Eosine: kleurt basische delen
2
0. Leerdoelen
× Lichtmicroscopische technieken kennen
× Elektronenmicroscopische technieken kennen (geavanceerde microscopie in Ba3)
× Beelden van coupes en microscopische technieken koppelen
× Verschillen tussen LM en EM preparatietechnieken verklaren
× Bewust worden van grootteverschillen in cellen en weefsels en het bereik van de
gehanteerde microscopische technieken
1. Inleiding
Grootte van enkele basiscellen:
× RBC: 6 µ𝑚
× Eicel – Follikel: < 100 µ𝑚
× Skeletspiercel (-vezel): Enkele mm tot tientallen cm’s
× Diameter mitochondrion: 0,2 µ𝑚
“Microscopie” afkomstig vh Griekse “mikros” (klein) en “skopeo” (kijken naar) betekent.
Microscoop moet 3 (F) vervullen:
1) Vergroting: Vergroot beeld van het specimen produceren
2) Resolutie: Details in het beeld scheiden
3) Contrast: Details zichtbaar maken voor het menselijk oog, een camera of een ander
waarnemingsapparaat/beeldopname-apparaat
Oog LM TEM
Vergroting 1000x 450.000 x
Resolutie 0,1 - 0,2 m𝑚 0,2 µ𝑚 0,1 n𝑚
Verschillende types van microscopen worden gebruikt in tal van situaties:
× Stellen van klinische diagnoses
× Structuren visualiseren voor onderwijs- of onderzoeksdoeleinden
× …
2. Resolutie en numerieke apertuur
Resolutie (scheidend- of oplossend vermogen): Vermogen v/e microscoop om 2 punten op coupe als
afzonderlijk te kunnen waarnemen. (voor beste microscopen bij optimale instelling 0,2µm)
!
𝑑= "# $%& '
(d = kleinst mogelijke afstand en 𝛼 = µ)
𝑁𝐴 = 𝑛 . 𝑠𝑖𝑛 µ
× 𝑛 = brekingsindex vh medium tss objectief & preparaat (max: 1)
× µ = halve tophoek van de apertuurkegel.
Droge objectieven (medium = lucht): NA steeds kleiner zijn dan 1.
Olie-immersielenzen: maximale NA ongeveer 1.4
Water-immersie lenzen: maximale NA 1.2.
1
, Histologie Methoden (microscopische technieken) 1e Ba BMW
Formule voor de resolutie v/e microscoop is: 𝑅 = 𝜆 /𝑁𝐴
× 𝜆 = golflengte van de belichting
× 𝑁𝐴 = numerieke apertuur van de objectieflens. (=kwaliteitswaardemeter voor het objectief)
Uit vergelijking kan een # zaken aflgeleid worden:
× Hoe hoger de NA, hoe beter de resolutie zal zijn want R zal kleiner worden.
× Hoe korter de golflengte (𝜆), hoe beter de resolutie wordt.
Þ Hoge (goede) 𝑅 bekomen als 𝑁𝐴 zo hoog mogelijk & 𝜆 vd belichting zo kort mogelijk houdt.
Belichtingssysteem moet altijd zo ingesteld staan dat een maximale helderheid bekomen wordt.
Lagere belichtingsintensiteit heeft lagere resolutie tot gevolg.
Toch spelen er andere factoren mee die remmend werken op onbeperkte vergrotingen. Indien dit
niet was: mogelijk om vergrotingen te bekomen die 1000x groter zijn dan specimen zelf
Breking van het licht is golflengte afhangkelijk!
Lensfouten
× Chromatische abberatie: elke kleur eigen brandpuntsafstand – appochromatische lenzen
× Sferische abberatie: brandpuntsafspand hangt af van afstand van invallende straal tov
optische as – PLAN-gecorrigeerde lenzen
× Astigmatisme: stralen in een vlak door de optische as hebben een andere brandpuntsafstand
dan stralen in een vlak dat niet door het midden van de lens gaat.
3. Voorbereiding van een preparaat voor conventionele lichtmicroscopie
× Uitstrijkje van cellen in suspensie (bloed) – Weefselsneden (coupes)
Werkwijze: FIXATIE – INBEDDING – SNIJDEN EN OPVANGEN - KLEUREN
1) Het te onderzoeken orgaan of weefsel uit dier verwijderen
2) Fixeren door: perfusie (via bloedbaan), immersie (onderdompelen: in bv formaldehyde) of
door chemische verbindingen “cross linking” (tuusen fixatief en de in het weefsel aanwezige
biomoleculen)
× Noodzakelijk om degradatie van weeefsel door bacteriën en enzymen tegen te gaan
× Door fixatie blijft (ultra)structuur van het weefsel bewaard
3) Gefixeerde weefsel spoelen, daarna dehydrateren (in baden met oplopende [ ] van ethanol),
daarna ingebed in paraffine (probleem: paraffine is waterafstotend)
4) Weefselblokje (omgeven dr paraffine) in houder microtoom geplaatst (snijdt dunne coupes)
5) Coupe (2 tot 7 µ𝑚 dik) opgevangen op draagglaasje en gedeparaffineerd d.m.v. xyleen
Overlangse, dwarse, en schuine doorsneden
6) Via omgekeerde alcoholreeks weefsel opnieuw in waterig milieu brengen om voor kleuring
× Kleuring = noodzakelijk. Ongekleurd weefsel ong zelfde brekingsindex als glas ® in gewone
LM met doorvallend licht weinig zichtbaar. Kleur zorgt vr differentiatie van versch structuren
× HE-kleuring: Hematoxyline: basische kleurstof (zure affiniteit). Eosine: kleurt basische delen
2
