H2. MATERIAAL EN METHODE VOOR DE ANALYSE VAN HET
EPIGENOOM
1. Histon modificaties
De complexiteit van histonmodificaties
• Histonstaarten kunnen gemodificeerd worden
o Methylatie, Acetylatie, Fosforylatie
o Op lysine, arginine (serine, threonine, …)
o nieuwe: propionylatie, butyrylatie, crotonylatie, formylatie, …
• Niet alleen de histonstaarten, maar ook de binnenkant (globulaire deel) kan soms
gemodificeerd zijn (MAAR verhouding 99% staart vs 1% binnenkant)
• enorme complexiteit van verschillende modificaties → elk jaar nieuwe ontdekkingen
• Er zijn meer dan 1 miljoen mogelijke
combinaties van post-translationele
modificaties op histon H3 bijvoorbeeld
• Elk histon heeft zijn unieke print van
modificaties
1. Western/ELISA
• Bedrijven maken anti-lichamen tegen histonmodificaties
• Western blot
o Histonen worden geïsoleerd uit cellen
o Uitplaten op een western gel
o Via de klassieke western blot analyse doen
o Figuur
▪ Voorbeelden van antilichamen tegen 1x gemethyleerd, 2x gemethyleerd, 4x
geacetyleerd,…
▪ Heel moeilijk om een onderscheid te maken tussen bv mono- en dimethyl
want zijn beiden niet geladen
• Peptide ELISA
o Plaat coaten met de anti-lichamen
o Lysaat toevoegen
o Secundaire AL met fluorofoor toevoegen
o klassieke ELISA
, nadeel
• door op voorhand AL uit te kiezen, verlies je informatie (want je maakt een selectie)
• modificaties zijn zo complex, dat er complexere methodes nodig zijn
2. Proteomics
Door de complexiteit van modificaties, zijn meer complexe methoden vereist
• Het is niet eenvoudig om te weten welke histonvorm aanwezig is in de cel
Klassieke proteomics
• Eiwitpreparaat maken om eiwitten te isoleren→ trypsine digest zodat eiwitten geïsoleerd
geraken → identificatie van peptiden in het proteomic experiment → je kan korte en lange
peptiden bekomen, je wilt zo kort mogelijke peptiden → de massa van deze peptiden ga je
vergelijken met peptiden in databases → identificatie van de peptiden/eiwitten
• De PC geeft de mogelijke modificaties weer en herkent patronen die veel voorkomen
• Je krijgt een exponentiële toename in de complexiteit van de histoncode
Histon proteomics: 2 identificaties uitvoeren
1. identificatie van het peptide
2. identificatie van de modificatie
a. Door te kijken naar de massaverschuiving die overeen komt met bv methylatie,
acetylatie, …
b. Het systeem moet hiervoor getraind worden
EPIGENOOM
1. Histon modificaties
De complexiteit van histonmodificaties
• Histonstaarten kunnen gemodificeerd worden
o Methylatie, Acetylatie, Fosforylatie
o Op lysine, arginine (serine, threonine, …)
o nieuwe: propionylatie, butyrylatie, crotonylatie, formylatie, …
• Niet alleen de histonstaarten, maar ook de binnenkant (globulaire deel) kan soms
gemodificeerd zijn (MAAR verhouding 99% staart vs 1% binnenkant)
• enorme complexiteit van verschillende modificaties → elk jaar nieuwe ontdekkingen
• Er zijn meer dan 1 miljoen mogelijke
combinaties van post-translationele
modificaties op histon H3 bijvoorbeeld
• Elk histon heeft zijn unieke print van
modificaties
1. Western/ELISA
• Bedrijven maken anti-lichamen tegen histonmodificaties
• Western blot
o Histonen worden geïsoleerd uit cellen
o Uitplaten op een western gel
o Via de klassieke western blot analyse doen
o Figuur
▪ Voorbeelden van antilichamen tegen 1x gemethyleerd, 2x gemethyleerd, 4x
geacetyleerd,…
▪ Heel moeilijk om een onderscheid te maken tussen bv mono- en dimethyl
want zijn beiden niet geladen
• Peptide ELISA
o Plaat coaten met de anti-lichamen
o Lysaat toevoegen
o Secundaire AL met fluorofoor toevoegen
o klassieke ELISA
, nadeel
• door op voorhand AL uit te kiezen, verlies je informatie (want je maakt een selectie)
• modificaties zijn zo complex, dat er complexere methodes nodig zijn
2. Proteomics
Door de complexiteit van modificaties, zijn meer complexe methoden vereist
• Het is niet eenvoudig om te weten welke histonvorm aanwezig is in de cel
Klassieke proteomics
• Eiwitpreparaat maken om eiwitten te isoleren→ trypsine digest zodat eiwitten geïsoleerd
geraken → identificatie van peptiden in het proteomic experiment → je kan korte en lange
peptiden bekomen, je wilt zo kort mogelijke peptiden → de massa van deze peptiden ga je
vergelijken met peptiden in databases → identificatie van de peptiden/eiwitten
• De PC geeft de mogelijke modificaties weer en herkent patronen die veel voorkomen
• Je krijgt een exponentiële toename in de complexiteit van de histoncode
Histon proteomics: 2 identificaties uitvoeren
1. identificatie van het peptide
2. identificatie van de modificatie
a. Door te kijken naar de massaverschuiving die overeen komt met bv methylatie,
acetylatie, …
b. Het systeem moet hiervoor getraind worden
