Samenvatting eiwitzuivering en analyse
Bron met eiwit → homogeniseren + stabiliseren → centrifugeren + filteren → zuiveren → analyseren
Adsorptie → heterogenen reactie waarbij verontreinigde
componenten gebonden worden aan absorbent, ook wel
kolom.
Absorptie → vasthouden van iets, opnemen
Gezuiverde eiwitten kunnen gebruikt worden voor:
- Studeren van enzymatische functies en regulering
- Onderzoeken van eiwit interacties
- Produceren van antistoffen
- 3D structuren
- Productie van agentia en enzymen
Basis technieken
Er zijn 20 verschillende aminozuren die overal terug te vinden zijn alleen met een andere
aminozuurvolgorde. Aminozuren bestaan uit een aminogroep, een carbon groep en ze hebben een
restgroep. De restgroep is vaak belangrijk voor het scheiden op eigenschappen.
Eigenschap Methode Wat houdt het in
Oplosbaarheid Precipitatie met ammoniumsulfaat Fysisch-chemisch proces waarbij er
gekeken wordt naar neerslag die
ontstaat
Grootte Size exclusion chromatography Scheiding op molecuul grootte
Iso-elektrisch punt Ion exchange chromatography Scheiding op lading
Specifieke binding Affinity chromatography Scheiding op specifieke bindingen.
Als je eiwitten gaat zuiveren loop je altijd tegen kleine dingen
aan…
1. Als je iets heel zuiver wilt hebben is dat vaak ten koste van
opbrengst, maar de kosten gaan omhoog.
2. Als je veel opbrengst wilt hebben is dit vaak minder zuiver
en zijn kosten soms ook lager.
3. Als je een bedrijf hebt waar kosten belangrijk zijn, en alles zo
goedkoop mogelijk moet gaat dit zowel ten koste van de
zuiverheid als van de opbrengst.
Dus alles staat met elkaar in verbinding.
, Unit → hoeveelheid enzymen die in 1 min per 1µmol substraat zitten.
Tot. Activiteit → totale hoeveelheid
die je na een zuiveringsstap
overhoudt; in totaal U
Specifieke activiteit → U/mg →
activiteit in hoeveelheid eiwit
Recovering → percentage
overgebleven activiteit na een
𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙𝑒 𝑎𝑐𝑡𝑖𝑣𝑖𝑡𝑒𝑖𝑡 𝑛𝑎
zuiveringsstap ; 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙𝑒 𝑎𝑐𝑡𝑖𝑣𝑖𝑡𝑒𝑖𝑡 𝑣𝑜𝑜𝑟 ∗
100%
Zuiveringsfactor → verhouding specifieke activiteiten na t.o.v. van zuivering vooraf;
𝑠𝑝𝑒𝑐𝑖𝑓𝑖𝑡𝑒𝑖𝑡𝑎𝑐𝑡𝑖𝑣𝑖𝑡𝑒𝑖𝑡 𝑛𝑎
𝑠𝑝𝑒𝑐𝑖𝑓𝑖𝑡𝑒𝑖𝑡𝑎𝑐𝑡𝑖𝑣𝑖𝑡𝑒𝑖𝑡 𝑣𝑜𝑜𝑟𝑎𝑓
Voorbeeld:
Aantal ml Totaal eiwit gehalte Enzymactiviteit (U/ml)
(mg/ml)
Voor zuivering 100 1*100 = 100 O,5
Na zuivering methode 25 1,3 *25 = 32,5 1,92
1
Na zuivering methode 0,4 0,1 *0,4 = 0,04 5
2
Totale activiteit
- Voor = 100 * 0,5 = 50 U
- Na methode 1 = 25 * 1,92 = 48 U
- Na methode 2 = 0,4 * 5 = 2 U
Recovery
- Methode 1 = 48/50*100% = 96%
- Methode 2 = 2/48*100% = 4%
Specifieke activiteit
- Methode 1 = 48/32,5 = 1,48 U/mg
- Methode 2 = 2/0,04 = 50 U/mg
Zuiveringsfactor
- Methode 1 = 1,48/0,5 = 2,96 keer zo zuiver
- Methode 2 = 50/0,5 = 100 keer zo zuiver
Homogeniseren → cellen kapot maken (lyseren) → kijken of je met een celwand te maken hebt of
celmembraan.
Methodes:
- Mechanische lysis
o Hoge druk
o Parelmolen
- Fysische lysis
Bron met eiwit → homogeniseren + stabiliseren → centrifugeren + filteren → zuiveren → analyseren
Adsorptie → heterogenen reactie waarbij verontreinigde
componenten gebonden worden aan absorbent, ook wel
kolom.
Absorptie → vasthouden van iets, opnemen
Gezuiverde eiwitten kunnen gebruikt worden voor:
- Studeren van enzymatische functies en regulering
- Onderzoeken van eiwit interacties
- Produceren van antistoffen
- 3D structuren
- Productie van agentia en enzymen
Basis technieken
Er zijn 20 verschillende aminozuren die overal terug te vinden zijn alleen met een andere
aminozuurvolgorde. Aminozuren bestaan uit een aminogroep, een carbon groep en ze hebben een
restgroep. De restgroep is vaak belangrijk voor het scheiden op eigenschappen.
Eigenschap Methode Wat houdt het in
Oplosbaarheid Precipitatie met ammoniumsulfaat Fysisch-chemisch proces waarbij er
gekeken wordt naar neerslag die
ontstaat
Grootte Size exclusion chromatography Scheiding op molecuul grootte
Iso-elektrisch punt Ion exchange chromatography Scheiding op lading
Specifieke binding Affinity chromatography Scheiding op specifieke bindingen.
Als je eiwitten gaat zuiveren loop je altijd tegen kleine dingen
aan…
1. Als je iets heel zuiver wilt hebben is dat vaak ten koste van
opbrengst, maar de kosten gaan omhoog.
2. Als je veel opbrengst wilt hebben is dit vaak minder zuiver
en zijn kosten soms ook lager.
3. Als je een bedrijf hebt waar kosten belangrijk zijn, en alles zo
goedkoop mogelijk moet gaat dit zowel ten koste van de
zuiverheid als van de opbrengst.
Dus alles staat met elkaar in verbinding.
, Unit → hoeveelheid enzymen die in 1 min per 1µmol substraat zitten.
Tot. Activiteit → totale hoeveelheid
die je na een zuiveringsstap
overhoudt; in totaal U
Specifieke activiteit → U/mg →
activiteit in hoeveelheid eiwit
Recovering → percentage
overgebleven activiteit na een
𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙𝑒 𝑎𝑐𝑡𝑖𝑣𝑖𝑡𝑒𝑖𝑡 𝑛𝑎
zuiveringsstap ; 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙𝑒 𝑎𝑐𝑡𝑖𝑣𝑖𝑡𝑒𝑖𝑡 𝑣𝑜𝑜𝑟 ∗
100%
Zuiveringsfactor → verhouding specifieke activiteiten na t.o.v. van zuivering vooraf;
𝑠𝑝𝑒𝑐𝑖𝑓𝑖𝑡𝑒𝑖𝑡𝑎𝑐𝑡𝑖𝑣𝑖𝑡𝑒𝑖𝑡 𝑛𝑎
𝑠𝑝𝑒𝑐𝑖𝑓𝑖𝑡𝑒𝑖𝑡𝑎𝑐𝑡𝑖𝑣𝑖𝑡𝑒𝑖𝑡 𝑣𝑜𝑜𝑟𝑎𝑓
Voorbeeld:
Aantal ml Totaal eiwit gehalte Enzymactiviteit (U/ml)
(mg/ml)
Voor zuivering 100 1*100 = 100 O,5
Na zuivering methode 25 1,3 *25 = 32,5 1,92
1
Na zuivering methode 0,4 0,1 *0,4 = 0,04 5
2
Totale activiteit
- Voor = 100 * 0,5 = 50 U
- Na methode 1 = 25 * 1,92 = 48 U
- Na methode 2 = 0,4 * 5 = 2 U
Recovery
- Methode 1 = 48/50*100% = 96%
- Methode 2 = 2/48*100% = 4%
Specifieke activiteit
- Methode 1 = 48/32,5 = 1,48 U/mg
- Methode 2 = 2/0,04 = 50 U/mg
Zuiveringsfactor
- Methode 1 = 1,48/0,5 = 2,96 keer zo zuiver
- Methode 2 = 50/0,5 = 100 keer zo zuiver
Homogeniseren → cellen kapot maken (lyseren) → kijken of je met een celwand te maken hebt of
celmembraan.
Methodes:
- Mechanische lysis
o Hoge druk
o Parelmolen
- Fysische lysis
