Ioana Christakis Bio-informa1ca: toepassingen
H1: Bacterial genomics
Doel workflow:
Ruwe sequen1edata
Biologische informa1e
(Long/short reads)
• Bacterieel genoom
• Welke genen
• Func2e genen
• Nieuwe func2es/ pathways/ resisten2egenen
Workflow startende van bacterieel DNA
Bandage= tool om Unicycler te visualiseren
1. Genome sequencing:
Doel: DNA van bacterie uitlezen.
Input: Volledig DNA
Technieken:
- Short reads: Illumina
- Long reads: Oxford Nanopore Technologies
Output: reads (FASTQ files, bevaNen ruwe data van sequencing)
1
,Ioana Christakis Bio-informa1ca: toepassingen
Illumina (sequencing by synthesis):
1. Fragmentatie (korte fragmenten)
2. Blunt ends maken
3. PCR met fusion primers om adaptors aan DNA fragmenten te binden = adaptor ligatie
4. Denaturatie (ssDNA)
5. Adaptor bindt op flow cel
6. Complementaire streng van 5’à3’
7. Originele verwijderd
8. Amplificatie: cluster vorming
9. Sequencing: sequencing primer toevoegen + fluorescente DNTPs (mixed) worden ingebouwd
a. Fluorescentie meten met laser
b. Fluorescente groep verhinderd binding volgende nucleotide
Resultaat:
- 1 file/sample: single end sequencing (maar langs 1 kant)
- 2 files/sample (R1 en R2)= paired end sequencing (hogere kwaliteit!)
Oxford Nanopore Sequencing:
Single cell sequencing methode:
- Lange reads kunnen gedaan worden
Nanopore= moleculaire structuur dat gat vormt in membraan
Motorproteine= bindt ds DNA/RNA, zitst deze open en laat ss aan gecontroleerde snelheid door pore
Voltage over membraan wordt gemeten (voltage komt overeen met 3 basen in de pore) à wordt via
logaritme geannalyseerd
2
,Ioana Christakis Bio-informa1ca: toepassingen
2. Quality control
Doel: controleren of sequencing goed genoeg is, want slechte data = slechte analyse.
Je kijkt naar:
- Kwaliteit per base
- Aanwezigheid van adapters (illumina)à moeten verwijderd worden
- Distribu1e verschillende nucleo1den
- Read lengths
- GC-content
- Duplica1es
Short reads: FastQC (gebruik zowel voor als na trimming)
Opmerking: als je 2 files hebt door paired end sequencing (R1 en R2)à beide controleren
Long reads: Nanoplot
Hoe donkerder groen het is, hoe meer
reads op deze posi3e in 2D figuur
x= lengte reads, y= kwaliteit
3. Trimming/filtering
Doel: Slechte stukken verwijderen en betrouwbare reads overhouden (kwaliteit wordt aan het einde
van een read vaak slecht). Slechte reads leiden tot slechte assemblies.
Short reads: TrimmomaCc
Illumina sequence data opkuisen:
- Adapters verwijderen
- Slechte kwaliteit basen verwijderen
- Te korte reads verwijderen (vaak slechte kwaliteit/niet volledig/onbruikbaar)
Long reads: FitLong
Slechte Nanopore reads verwijderen
Nanopore heee hogere error rate!
4. Genome assembly
Doel: Reads (fragmenten) samenvoegen tot volledig bacterieel genoom. Je zoekt dus naar
overlappingen tussen de reads om grotere opeenvolgende stukken DNA te maken (con>gs).
Tool: Unicycler
è Ideaal voor plasmiden (vaak veel repeats)
Unicycler
Hybride assembly (eerst short dan long reads):
1. Short read assembly met SPAdes:
Overlappingen (con1gs) zoeken. Zeer accuraat, maar niet mooi naast elkaar door de vele
repeats.
à short reads maken eerste assembly graph (netwerk van knopen en verbindingen)
3
, Ioana Christakis Bio-informa1ca: toepassingen
2. Long reads overbruggen een langere sequen1e. Hierdoor kun je de con1gs in juiste volgorde
plaatsen + gaps opvullen.
à verdere mapping op assembly graph
3. Assembly graph vereenvoudigen (grotere con1gs of zelf circulair genoom)
4. SequenCe oppoetsen: short reads worden gebruikt om fouten in de long-read assembly te
verbeteren (via Pilon).
Bandage
Tool om assembly graph te visualiseren. Je krijg connec1es, circulaire structuren.
5. Genome annotation
Annota1e= bepalen waar genen liggen en waarvoor ze coderen
(want na genome assembly heb je gewoon de volgorde van basen, je weet nog niets over genen)
Tool: PROKKA
PROKKA
=automa1sche annota1e van bacteriële genomen door vergelijking met databanken
1. Prodigal zoekt genen (gaat op zoek naar mogelijke ORF/coderende sequen1es)
2. Vergelijking met andere databases van bekende bacteriële eiwiNen.
a. Allignments: BLAST*
b. Hiërarchische zoekopdracht:
i. Start van kleine betrouwbare database (eigen database of UniProt)
ii. Grotere, domainspecifieke databases (RefSeq)
minder strikt maar grote coverage, bevat volledige bacteriële genomen voor specifiek genus
iii. Proteine families/HMM profiel databases (“lijkt dit eiwit op een bepaalde familie?”)
3. Resultaat= lijst met coördinaten op het genoom "Hier ligt gen/ORF X dat mss codeert voor Y"
4. Geen match= hypotheCcal protein (voorspeld gen zonder gekende func1e)
*Makeblastdb maakt een Blast database van een FASTA file. Blast kan niet efficiënt allignments
zoeken in een gewone FASTA file. Daarom kan een database gedownload worden naar een eigen
server systeem. Zo kan lokaal gezocht worden in eigen database. è Wordt dus gebruikt door PROKKA
4
H1: Bacterial genomics
Doel workflow:
Ruwe sequen1edata
Biologische informa1e
(Long/short reads)
• Bacterieel genoom
• Welke genen
• Func2e genen
• Nieuwe func2es/ pathways/ resisten2egenen
Workflow startende van bacterieel DNA
Bandage= tool om Unicycler te visualiseren
1. Genome sequencing:
Doel: DNA van bacterie uitlezen.
Input: Volledig DNA
Technieken:
- Short reads: Illumina
- Long reads: Oxford Nanopore Technologies
Output: reads (FASTQ files, bevaNen ruwe data van sequencing)
1
,Ioana Christakis Bio-informa1ca: toepassingen
Illumina (sequencing by synthesis):
1. Fragmentatie (korte fragmenten)
2. Blunt ends maken
3. PCR met fusion primers om adaptors aan DNA fragmenten te binden = adaptor ligatie
4. Denaturatie (ssDNA)
5. Adaptor bindt op flow cel
6. Complementaire streng van 5’à3’
7. Originele verwijderd
8. Amplificatie: cluster vorming
9. Sequencing: sequencing primer toevoegen + fluorescente DNTPs (mixed) worden ingebouwd
a. Fluorescentie meten met laser
b. Fluorescente groep verhinderd binding volgende nucleotide
Resultaat:
- 1 file/sample: single end sequencing (maar langs 1 kant)
- 2 files/sample (R1 en R2)= paired end sequencing (hogere kwaliteit!)
Oxford Nanopore Sequencing:
Single cell sequencing methode:
- Lange reads kunnen gedaan worden
Nanopore= moleculaire structuur dat gat vormt in membraan
Motorproteine= bindt ds DNA/RNA, zitst deze open en laat ss aan gecontroleerde snelheid door pore
Voltage over membraan wordt gemeten (voltage komt overeen met 3 basen in de pore) à wordt via
logaritme geannalyseerd
2
,Ioana Christakis Bio-informa1ca: toepassingen
2. Quality control
Doel: controleren of sequencing goed genoeg is, want slechte data = slechte analyse.
Je kijkt naar:
- Kwaliteit per base
- Aanwezigheid van adapters (illumina)à moeten verwijderd worden
- Distribu1e verschillende nucleo1den
- Read lengths
- GC-content
- Duplica1es
Short reads: FastQC (gebruik zowel voor als na trimming)
Opmerking: als je 2 files hebt door paired end sequencing (R1 en R2)à beide controleren
Long reads: Nanoplot
Hoe donkerder groen het is, hoe meer
reads op deze posi3e in 2D figuur
x= lengte reads, y= kwaliteit
3. Trimming/filtering
Doel: Slechte stukken verwijderen en betrouwbare reads overhouden (kwaliteit wordt aan het einde
van een read vaak slecht). Slechte reads leiden tot slechte assemblies.
Short reads: TrimmomaCc
Illumina sequence data opkuisen:
- Adapters verwijderen
- Slechte kwaliteit basen verwijderen
- Te korte reads verwijderen (vaak slechte kwaliteit/niet volledig/onbruikbaar)
Long reads: FitLong
Slechte Nanopore reads verwijderen
Nanopore heee hogere error rate!
4. Genome assembly
Doel: Reads (fragmenten) samenvoegen tot volledig bacterieel genoom. Je zoekt dus naar
overlappingen tussen de reads om grotere opeenvolgende stukken DNA te maken (con>gs).
Tool: Unicycler
è Ideaal voor plasmiden (vaak veel repeats)
Unicycler
Hybride assembly (eerst short dan long reads):
1. Short read assembly met SPAdes:
Overlappingen (con1gs) zoeken. Zeer accuraat, maar niet mooi naast elkaar door de vele
repeats.
à short reads maken eerste assembly graph (netwerk van knopen en verbindingen)
3
, Ioana Christakis Bio-informa1ca: toepassingen
2. Long reads overbruggen een langere sequen1e. Hierdoor kun je de con1gs in juiste volgorde
plaatsen + gaps opvullen.
à verdere mapping op assembly graph
3. Assembly graph vereenvoudigen (grotere con1gs of zelf circulair genoom)
4. SequenCe oppoetsen: short reads worden gebruikt om fouten in de long-read assembly te
verbeteren (via Pilon).
Bandage
Tool om assembly graph te visualiseren. Je krijg connec1es, circulaire structuren.
5. Genome annotation
Annota1e= bepalen waar genen liggen en waarvoor ze coderen
(want na genome assembly heb je gewoon de volgorde van basen, je weet nog niets over genen)
Tool: PROKKA
PROKKA
=automa1sche annota1e van bacteriële genomen door vergelijking met databanken
1. Prodigal zoekt genen (gaat op zoek naar mogelijke ORF/coderende sequen1es)
2. Vergelijking met andere databases van bekende bacteriële eiwiNen.
a. Allignments: BLAST*
b. Hiërarchische zoekopdracht:
i. Start van kleine betrouwbare database (eigen database of UniProt)
ii. Grotere, domainspecifieke databases (RefSeq)
minder strikt maar grote coverage, bevat volledige bacteriële genomen voor specifiek genus
iii. Proteine families/HMM profiel databases (“lijkt dit eiwit op een bepaalde familie?”)
3. Resultaat= lijst met coördinaten op het genoom "Hier ligt gen/ORF X dat mss codeert voor Y"
4. Geen match= hypotheCcal protein (voorspeld gen zonder gekende func1e)
*Makeblastdb maakt een Blast database van een FASTA file. Blast kan niet efficiënt allignments
zoeken in een gewone FASTA file. Daarom kan een database gedownload worden naar een eigen
server systeem. Zo kan lokaal gezocht worden in eigen database. è Wordt dus gebruikt door PROKKA
4
