CYTOLOGIE
Leerstof = hoorcolleges + ppt (notes = geen leerstof)
MCB = extra info + afbeeldingen
HOOFDSTUK 1: PREPAREREN EN OBSERVEREN VAN CELLEN EN WEEFSELS
Doel: cellen en weefsels observeerbaar maken voor LM en EM
Probleem: weinig licht (elektronen) doorlatend + weinig contrast in biologisch materiaal
CELCULTUUR – HISTORISCH
1907 (Harrison): 3D tissue culture: zenuw uit kikkerembryo in lymfe op glasplaatje met depressie
1948 (Earle): 2D monolaagculturen: “simuleren” van 3D organen/weefsels terwijl echte 3D culturen enkel bij uitzonderlijke
condities voorkomen (bv: bij abnormale celdeling door tumorcellen, …)
Oorspronkelijk: monolaagculturen = enkel uit orgaanecplanten (prim culturen) in EMEM (earle’s minimum essential
medium)
Later: stabiele cellijnen met in theorie onbeperkte levensduur (tenzij tumoraal, na crisis => afsterven)
CELCULTIVERING
Cellijn maken van stukje orgaan/tumor
Stappen:
1) Weefsel enzymatisch behandelen
2) Cellen zakken uit of worden naar bodem gecentrifugeerd
3) Cellen in petrischaal
4) Hopen dat cellen behandeling overleven en groeien
5) Indien confluentie laag => cellen losmaken en splitsen
TYPISCHE CELCULTUREN
Monolaagcultuur (1)
Kolonie van cellen uit dezelfde meerdere individuele cellen (2)
,CULTUURCONDITIES
MEM (minimum essential medium):
Isotonische zouten
Energiebron (glucose)
Essentiele AZ en vitamines
Serum = essentieel maar duur natuurprod (kalf, paard) met kwaliteitsvariatie
Andere klassieke celmedia: DMEM, M199, McCoy's, RPMI1640
Andere culturen worden gegroeid in atmosfeer (5% CO2 in lucht) goede pH (7,4)
CULTUURRECIPIENTEN
Gesloten flessen: warmtekamer => CO2 toevoegen voor dichtdraaien
Rollerflessen voor groot opp cellen maar weinig medium
Open cultuurplaten: CO2 oven
OORSPRONG VAN CELLEN, CELLIJNEN
Cellen aankopen of van patiënt
GROEISUBSTRATEN EN -PROCEDURES
Aanmaken van tumorcellen groeien verder = celcultuur groeit sneller
Goed groeimedium nodig
Adherente cellen = groeien op substraat (vast)
Fysische drager = plastic waarop cellen groeien beschermt ook tegen anoïkis (= celdood/apoptose) => zeker nodig voor
adherente cellen, niet voor circulerende bloedcellen of tumorcellen
Vb: glas (neg geladen), voorbehandeld polystyreen, coatings om in vivo na te bootsen (vb: (EC matrix), sterk pos poly-D-
lysine, geconditioneerd milieu (ev feeder))
DOEL
Aspecifieke fysische interactie: toelaten van cellulaire adhesie en celspreiding (<-> anchorage independence)
Specifieke functionele interactie met onderliggende cellen en ECM differentiatie-inductie door stimulatie => basaal
membraan of basale lamine (= BM of basement membrane = tussen dermis en epidermis)
,Interactie van dierlijke huidcellen (epidermis – BM – dermis) met micro-omgeving => onderste laag epitheelcellen in
opperhuid: delende stamcellen van huid polarisatie + functionele controle door contact met BM
CELDENSITEIT – AFHANKELIJKE INHIBITIE
Cellen in cultuur delen tot ze monolaag vormen (= petrischaal vol) ‘contactinhibitie’ van celproliferatie: o.a. omwille van
concurrentie voor mitogenen
Vers medium delingen herbeginnen
Efficiënter: splits cultuur in dochtercelen => trypsine-EDTA (ethyleendiaminetetriacetaat) procedure
TUMORCELLEN
Groeien op elkaar (<-> gewone cellen) doordat tumorcellen vermogen van contactinhibitie verloren zijn
GROEI IN 2D EN 3D CULTUREN BOOTSEN IN VIVO OMGEVING NA
Culturen verbeteren 3D maken
MDCK cellen groeien op filter 2D cultuur OF groeien in omgeving met juiste EC componenten cysten = 3D eiwitten
apicaal of basolateraal in cel
PROCEDURE VAN CELTRANSFER
Gebeurt door verdunning bij suspensieculturen (ev na centrifugeren en heropname in vers mileu)
Celtransfer van suspensieculturen
Adherente cellen: celtransfer wanneer confluentie (= samenkomen) van cellaag optreedt (na 3-7 dagen)
Behandeling met trypsine-EDTA:
Trypsine-EDTA = maagprotease => alle eiwitten op opp van cel wegknippen
EDTA (ethyleendiaminetetriacetaat), cheleert Ca en Mg, interfereert met IC adhesie en cel-substraat binding
Geschikte condities: cellen los van substraat en elkaar suspensie van levende opgebolde cellen (optimaal als
monocellulair (= geen meercellige aggregaten)) uitverdunning = splitsen van cellen: 1/10 van cellen naar nieuwe
petrischaal (normaal: 1/3, tumor: 1/30)
Resterende trypsine = inhibitie door protease-inhibitoren (natuurlijk aanwezig in serum)
Cellen in contact met elkaar door eiwitten/calcium => trypsine knipt binding weg => cellen liggen apart
Steriel! => geen bacterien/virussen
STAPPEN BIJ CELADHESIE EN -SPREIDING
muisfibroblasten na uitplating als individuele cellen (SEM opnames)
DIFFERENTIATIE IN VITRO
Spontaan (myoblast myotube)
Kleuring!
STAMCELLEN
, Worden gebruikt om bv organen te maken
Stamcel = cel die vermogen heeft om zicht voortdurend te delen en te differentiëren in verschillende soorten cellen/weefsel
Eigenschappen:
Vermogen tot zelfvernieuwing => zichzelf delen (kopieën)
Vermogen om te differentiëren volwassen celtypen ontstaan
SOORTEN STAMCELLEN
Totipotent: stamcel met potentie om tot volledige foetus uit te groeien
1 cel = 1 embryo
Ontstaat bij eerste deling na bevruchting
Pluripotent: stamcel met potentie om tot veel te ontwikkelen maar niet alles
embryo kan niet met 1 cel gemaakt wordtrypen maar wel organen/cellen
ontstaat na vorming van blastocyt buitenste cellen op blastocyt zijn pluripotent (voor vorming van placenta)
Multipotent: op ieder orgaan heb je stamcellen die dat deel
van het lichaam aanmaken (vb: stamcel van in longen kan geen
andere cellen/organen aanmaken)
meer ontwikkelde en gespecialiseerde cellen =>
verantwoordelijk voor 1 soort cel/orgaan
ontstaat na verdere ontwikkeling van individuele cellen in
binnenste celmassa van embryo
AANMAAK MUIS EMBRYONALE STAMCELLEN
Kan continue gaan delen
Stamcellen groeien graag in bijzijn van andere cellen => dubbele cultuur
Kan ook voor mens (vanaf embryo) => gebeurt niet meer (ethische kwestie)
positief over stamcelonderzoek zolang het niet dient om “betere mens” te maken medicatie, ontwikkeling van cellen
embryonale stamcellen nodig uit embryo’s van IVF-trajecten => ethisch soms onverantwoord in bepaalde religies
(moord? Overgebleven embryo’s uit IVF weggooien? Leeftijd van embryo? (12 dagen in BE))
GEINDUCEERDE PLURIPOTENTE STAMCELLEN
= iPSC = ethisch minder beladen
Stamcellen van levende mens gebruiken om organen/neuronen te maken
Gebruikt voor screening van geneesmiddelen, ook genezing van cellen + terug naar patiënt
= pluripotent stamcellen in vitro
Orgaan in vitro gemaakt door stamcellen = organoïd
KWALITEITSCONTROLE
Bacteriën mogen niet gebruikt worden => contaminatie met micro-organismen
vb: gisten, schimmels, antibioticaresistente mycoplasma’s (PPLO: pleuropneumonia-like organism = parasitair)
verstoren cellulaire metabolisme
moeilijk detecteerbaar en elimineerbaar
Leerstof = hoorcolleges + ppt (notes = geen leerstof)
MCB = extra info + afbeeldingen
HOOFDSTUK 1: PREPAREREN EN OBSERVEREN VAN CELLEN EN WEEFSELS
Doel: cellen en weefsels observeerbaar maken voor LM en EM
Probleem: weinig licht (elektronen) doorlatend + weinig contrast in biologisch materiaal
CELCULTUUR – HISTORISCH
1907 (Harrison): 3D tissue culture: zenuw uit kikkerembryo in lymfe op glasplaatje met depressie
1948 (Earle): 2D monolaagculturen: “simuleren” van 3D organen/weefsels terwijl echte 3D culturen enkel bij uitzonderlijke
condities voorkomen (bv: bij abnormale celdeling door tumorcellen, …)
Oorspronkelijk: monolaagculturen = enkel uit orgaanecplanten (prim culturen) in EMEM (earle’s minimum essential
medium)
Later: stabiele cellijnen met in theorie onbeperkte levensduur (tenzij tumoraal, na crisis => afsterven)
CELCULTIVERING
Cellijn maken van stukje orgaan/tumor
Stappen:
1) Weefsel enzymatisch behandelen
2) Cellen zakken uit of worden naar bodem gecentrifugeerd
3) Cellen in petrischaal
4) Hopen dat cellen behandeling overleven en groeien
5) Indien confluentie laag => cellen losmaken en splitsen
TYPISCHE CELCULTUREN
Monolaagcultuur (1)
Kolonie van cellen uit dezelfde meerdere individuele cellen (2)
,CULTUURCONDITIES
MEM (minimum essential medium):
Isotonische zouten
Energiebron (glucose)
Essentiele AZ en vitamines
Serum = essentieel maar duur natuurprod (kalf, paard) met kwaliteitsvariatie
Andere klassieke celmedia: DMEM, M199, McCoy's, RPMI1640
Andere culturen worden gegroeid in atmosfeer (5% CO2 in lucht) goede pH (7,4)
CULTUURRECIPIENTEN
Gesloten flessen: warmtekamer => CO2 toevoegen voor dichtdraaien
Rollerflessen voor groot opp cellen maar weinig medium
Open cultuurplaten: CO2 oven
OORSPRONG VAN CELLEN, CELLIJNEN
Cellen aankopen of van patiënt
GROEISUBSTRATEN EN -PROCEDURES
Aanmaken van tumorcellen groeien verder = celcultuur groeit sneller
Goed groeimedium nodig
Adherente cellen = groeien op substraat (vast)
Fysische drager = plastic waarop cellen groeien beschermt ook tegen anoïkis (= celdood/apoptose) => zeker nodig voor
adherente cellen, niet voor circulerende bloedcellen of tumorcellen
Vb: glas (neg geladen), voorbehandeld polystyreen, coatings om in vivo na te bootsen (vb: (EC matrix), sterk pos poly-D-
lysine, geconditioneerd milieu (ev feeder))
DOEL
Aspecifieke fysische interactie: toelaten van cellulaire adhesie en celspreiding (<-> anchorage independence)
Specifieke functionele interactie met onderliggende cellen en ECM differentiatie-inductie door stimulatie => basaal
membraan of basale lamine (= BM of basement membrane = tussen dermis en epidermis)
,Interactie van dierlijke huidcellen (epidermis – BM – dermis) met micro-omgeving => onderste laag epitheelcellen in
opperhuid: delende stamcellen van huid polarisatie + functionele controle door contact met BM
CELDENSITEIT – AFHANKELIJKE INHIBITIE
Cellen in cultuur delen tot ze monolaag vormen (= petrischaal vol) ‘contactinhibitie’ van celproliferatie: o.a. omwille van
concurrentie voor mitogenen
Vers medium delingen herbeginnen
Efficiënter: splits cultuur in dochtercelen => trypsine-EDTA (ethyleendiaminetetriacetaat) procedure
TUMORCELLEN
Groeien op elkaar (<-> gewone cellen) doordat tumorcellen vermogen van contactinhibitie verloren zijn
GROEI IN 2D EN 3D CULTUREN BOOTSEN IN VIVO OMGEVING NA
Culturen verbeteren 3D maken
MDCK cellen groeien op filter 2D cultuur OF groeien in omgeving met juiste EC componenten cysten = 3D eiwitten
apicaal of basolateraal in cel
PROCEDURE VAN CELTRANSFER
Gebeurt door verdunning bij suspensieculturen (ev na centrifugeren en heropname in vers mileu)
Celtransfer van suspensieculturen
Adherente cellen: celtransfer wanneer confluentie (= samenkomen) van cellaag optreedt (na 3-7 dagen)
Behandeling met trypsine-EDTA:
Trypsine-EDTA = maagprotease => alle eiwitten op opp van cel wegknippen
EDTA (ethyleendiaminetetriacetaat), cheleert Ca en Mg, interfereert met IC adhesie en cel-substraat binding
Geschikte condities: cellen los van substraat en elkaar suspensie van levende opgebolde cellen (optimaal als
monocellulair (= geen meercellige aggregaten)) uitverdunning = splitsen van cellen: 1/10 van cellen naar nieuwe
petrischaal (normaal: 1/3, tumor: 1/30)
Resterende trypsine = inhibitie door protease-inhibitoren (natuurlijk aanwezig in serum)
Cellen in contact met elkaar door eiwitten/calcium => trypsine knipt binding weg => cellen liggen apart
Steriel! => geen bacterien/virussen
STAPPEN BIJ CELADHESIE EN -SPREIDING
muisfibroblasten na uitplating als individuele cellen (SEM opnames)
DIFFERENTIATIE IN VITRO
Spontaan (myoblast myotube)
Kleuring!
STAMCELLEN
, Worden gebruikt om bv organen te maken
Stamcel = cel die vermogen heeft om zicht voortdurend te delen en te differentiëren in verschillende soorten cellen/weefsel
Eigenschappen:
Vermogen tot zelfvernieuwing => zichzelf delen (kopieën)
Vermogen om te differentiëren volwassen celtypen ontstaan
SOORTEN STAMCELLEN
Totipotent: stamcel met potentie om tot volledige foetus uit te groeien
1 cel = 1 embryo
Ontstaat bij eerste deling na bevruchting
Pluripotent: stamcel met potentie om tot veel te ontwikkelen maar niet alles
embryo kan niet met 1 cel gemaakt wordtrypen maar wel organen/cellen
ontstaat na vorming van blastocyt buitenste cellen op blastocyt zijn pluripotent (voor vorming van placenta)
Multipotent: op ieder orgaan heb je stamcellen die dat deel
van het lichaam aanmaken (vb: stamcel van in longen kan geen
andere cellen/organen aanmaken)
meer ontwikkelde en gespecialiseerde cellen =>
verantwoordelijk voor 1 soort cel/orgaan
ontstaat na verdere ontwikkeling van individuele cellen in
binnenste celmassa van embryo
AANMAAK MUIS EMBRYONALE STAMCELLEN
Kan continue gaan delen
Stamcellen groeien graag in bijzijn van andere cellen => dubbele cultuur
Kan ook voor mens (vanaf embryo) => gebeurt niet meer (ethische kwestie)
positief over stamcelonderzoek zolang het niet dient om “betere mens” te maken medicatie, ontwikkeling van cellen
embryonale stamcellen nodig uit embryo’s van IVF-trajecten => ethisch soms onverantwoord in bepaalde religies
(moord? Overgebleven embryo’s uit IVF weggooien? Leeftijd van embryo? (12 dagen in BE))
GEINDUCEERDE PLURIPOTENTE STAMCELLEN
= iPSC = ethisch minder beladen
Stamcellen van levende mens gebruiken om organen/neuronen te maken
Gebruikt voor screening van geneesmiddelen, ook genezing van cellen + terug naar patiënt
= pluripotent stamcellen in vitro
Orgaan in vitro gemaakt door stamcellen = organoïd
KWALITEITSCONTROLE
Bacteriën mogen niet gebruikt worden => contaminatie met micro-organismen
vb: gisten, schimmels, antibioticaresistente mycoplasma’s (PPLO: pleuropneumonia-like organism = parasitair)
verstoren cellulaire metabolisme
moeilijk detecteerbaar en elimineerbaar
