Biochemie vragen
Hoofdstuk 3: Aminozuren
HOOFDVRAGEN
• Chromatografie
niet alle chromatografieën maar bv 2 gevraagd en die uitleggen
Om eiwitten te scheiden en zuiveren moet eerst het weefsel gemixt worden
waardoor er allemaal aparte stukjes van structuren zijn. Deze stukjes
moeten gescheiden worden om uiteindelijk enkel eiwitten over te houden.
Deze scheiding gebeurt aan de hand van differentiële centrifugatie. Hierbij
ondergaat de oplossing centrifugatie aan steeds hogere snelheden zodat de
onderdelen met de hoogste densiteit zullen neerslagen. Deze neerslag
wordt dan verwijderd; dit is de zuivering. Na de laatste centrifugatie, aan
zeer hoge snelheid, zal er enkel nog een eiwitmengsel overblijven, geen
celorganellen meer.
De eiwit-oplossing kan worden gescheiden in verschillende fracties door
middel van chromatografie. Er zijn verschillende soorten chromatografieën.
Het verschil tussen de soorten chromatografieën zit in hoe de moleculen
van de mobiele fase interageren met de moleculen van de stationaire fase.
1. Kolomchromatografie
Bij kolomchromatografie bestaat de vaste fase uit een poreuze matrix
waar de mobiele fase doorheen beweegt. De snelheid waarmee de
vloeistof zich doorheen de matrix beweegt is afhankelijk van de
eigenschappen van de vloeistof en van de matrix. Zetmeel kan
bijvoorbeeld gebruikt worden als vaste fase. Zetmeel is een polaire stof,
wat betekent dat de polaire delen van het eiwitmengsel (de eiwitten met
meer polaire aminozuren) trager doorheen de matrix zullen bewegen dan
de apolaire delen. Op die manier ontstaat er verschillende banden,
gescheiden van elkaar door middel van de polariteit. Naarmate de stof
langer doorheen de kolom loopt zullen de banden en de spatie ertussen
verbreden, waarna ze apart kunnen opgevangen worden onderaan de
kolom. Nu zijn er verschillende fracties aan eiwitmengsel gescheiden van
elkaar. Belangrijk om op te merken is dat er geen aparte eiwitten geïsoleerd zijn, maar slechts fracties
met gelijkaardige polariteit.
1
Biochemie 22/23
, 2. Ionenuitwisselingschromatografie
Bij deze chromatografie interageren de geladen eiwitten met een matrix die
bestaat uit een synthetisch polymeer met geladen groepen. Dit kan een matrix
van anionen (kationen uitwisselingschromatografie) of van kationen (anionen
uitwisselingschromatografie) zijn. Als de matrix bijvoorbeeld bestaat uit
negatief geladen deeltjes, zullen de meer positieve eiwitten van het mengsel (de
eiwitten met meer positief geladen aminozuren) trager doorheen de matrix
bewegen dan de negatievere eiwitten. Zo ontstaat er een bandenpatroon aan
de hand van de lading van de eiwitten, en deze banden kunnen weer een voor
een opgevangen worden onderaan de kolom. De lading van eiwitten en dus ook
de scheiding is afhankelijk van de pH van de oplossing.
3. Size-exclusion chromatography (moleculaire-zeef chromatografie)
In deze vorm van chromatografie worden eiwitfracties gescheiden op basis van
hun grootte. De matrix bestaat uit kralen van polymeren met kanaaltjes in waar
de moleculen doorheen bewegen. Kleine eiwitfracties kunnen makkelijker in
die kanaaltjes waardoor het langer duurt om doorheen de kolom te bewegen
omdat ze telkens in en uit de kanaaltjes moeten gaan. Grotere moleculen
bewegen vrijer doorheen de matrix waardoor ze sneller zullen bewegen en er
weer een bandenpatroon zal ontstaan.
4. Affiniteitschromatografie
Hierbij bestaat de matrix uit liganden die specifiek met bepaalde
eiwitten kunnen binden. Een veel gebruikte toepassing van deze
chromatografie is de immuno-affiniteitschromatografie. Hierbij
worden antilichamen gebruikt als ligand: die kunnen zeer
specifiek binden met één bepaald eiwit (deze eiwitten hebben
dus een hoge affiniteit voor dit ligand). Dit eiwit zal blijven
hangen in de kolom terwijl de rest van het eiwitmengsel er
doorheen loopt. Hierna moeten de eiwitten dan weer
losgemaakt worden van het ligand. Dit kan door een mengsel
met hoge zoutconcentratie doorheen de kolom te laten lopen
waardoor de ionaire eiwit-ligand reacties verbroken worden of
door competitie met andere liganden waarmee het eiwit kan
binden zodat het los komt van de matrix en door de kolom kan lopen.
2
Biochemie 22/23
, • Elektroforese
immunoblot uitleggen = typische vraag
Elektroforese is het scheiden van eiwitten in een elektrisch veld.
Omdat de eiwitten een netto lading hebben zullen ze bewegen
doorheen het veld naar de richting van de tegengestelde lading. De
matrix is een cross linked polymeer, bv. polyacrylamide -> PAGE =
polyacrylamide gel electroforese. De matrix is een soort van zeef
waar eiwitten worden gescheden naar hun massa en vorm. De
eiwitten worden behandeld met SDS, een detergentmolecule. Deze
molecule heeft een polaire kop en een apolaire staart. SDS zorgt
ervoor dat eiwitten denatureren waardoor ze allemaal bolvormig
worden en het geeft een uniforme negatieve lading aan de reeds
geladen eiwitten waardoor ze aangetrokken worden door de
positieve pool op basis van hun grootte en niet hun lading, die kan verschillen. Grote eiwitten bewegen
moeilijker doorheen de gel waardoor ze trager zijn dan kleinere eiwitten, zo ontstaat een
bandenpatroon en kunnen de eiwitten geïdentificeerd worden. Eiwitten zijn kleurloos dus er wordt
een kleurstof toegevoegd, bv. Coomassie blue die aan de eiwitten kan binden zodat ze zichtbaar
worden en geïdentificeerd kunnen worden.
Om de massa van het onbekende eiwit te
schatten wordt het vergeleken met merker
eiwitten. Dit zijn eiwitten waarvan de massa al
gekend is, aan de hand hiervan kan gekeken
worden naar waar het onbekende eiwit zich
bevindt tov. de merker eiwitten en kan de massa
geschat worden. De massa van de
merkereiwitten wordt uitgezet in functie van
hoe ver het eiwit heeft bewogen in de gel. Dit is
de relative migration. Hierdoor krijg je een
rechte, en als de bewogen afstand van het
onbekende eiwit gekend is kan adhv. lineaire interpolatie vrij nauwkeurig de massa berekend worden.
Een belangrijk deel van de elektroforese is de tracking dye, bv. broomfenol blauw. Deze kleurstof is
kleiner dan de eiwitten en gaat dus sneller. Aan de hand van de tracking dye kan dus ingeschat worden
hoe ver de snelste eiwitten al gemigreerd zijn zodat de elektroforese op tijd gestopt kan worden zodat
de banden niet in elkaar overgaan.
Isoelectric focusing: Eerst worden de eiwitten onderworpen aan een pH gradiënt. Aan een met gel
gevuld buisje wordt een pH gradiënt aangebracht. De eiwitten worden daarna aan een opening
toegevoegd en er wordt een elektrisch veld over het buisje aangebracht. Net zoals bij PAGE gaan de
eiwitten migreren onder invloed van hun ladingen (AZ). Eens ze bij de pH = PI (iso-elektrisch punt)
aankomen, worden ze neutraal geladen en stoppen ze met bewegen. Nu zijn ze gescheiden op PI.
2D elektroforese: eerst PI dan PAGE. Aangezien de eiwitten na PI neutraal zijn => SDS toevoegen voor
lading.
3
Biochemie 22/23
, Een immunoblot / Western blot is een techniek
waarmee een specifiek eiwit in een mengsel van
eiwitten door middel van antilichamen
gedetecteerd kan worden. Blotting = eiwitten
overbrengen op nitrocellulose membraam.
In de eerste stap wordt het eiwitmengsel door
middel van gel-elektroforese in afzonderlijke
eiwitbanden gescheiden in een dragermatrix
(SDS-PAGE, Native-PAGE, isoelectric focusing, 2D-
gel-elektroforese), afhankelijk van de grootte van
het eiwit, de lading of andere eigenschappen.
De afgescheiden eiwitbanden worden vervolgens
overgebracht van de gel naar een vast
draagmembraan (nitrocellulose) voor de Western
blot. Dit proces wordt blotting genoemd. Daar
worden ze geblokkeerd met melk (= blocking
agent) om niet-specifieke antilichaambinding te
voorkomen, en vervolgens gekleurd met
antilichamen die specifiek zijn voor het doeleiwit.
Het eiwit waarin men geïnteresseerd is kan gedetecteerd worden met een voor dat eiwit specifiek
antilichaam. Om dit specifiek gebonden antilichaam zichtbaar te maken wordt na incubatie met dit
eerste antilichaam de blot behandeld met een tweede antilichaam dat bindt aan het eerste
antilichaam. Dit tweede antilichaam is gelabeld zodat men precies kan zien waar het eerste
antilichaam gebonden heeft en dus waar het eiwit zich bevindt.
4
Biochemie 22/23
Hoofdstuk 3: Aminozuren
HOOFDVRAGEN
• Chromatografie
niet alle chromatografieën maar bv 2 gevraagd en die uitleggen
Om eiwitten te scheiden en zuiveren moet eerst het weefsel gemixt worden
waardoor er allemaal aparte stukjes van structuren zijn. Deze stukjes
moeten gescheiden worden om uiteindelijk enkel eiwitten over te houden.
Deze scheiding gebeurt aan de hand van differentiële centrifugatie. Hierbij
ondergaat de oplossing centrifugatie aan steeds hogere snelheden zodat de
onderdelen met de hoogste densiteit zullen neerslagen. Deze neerslag
wordt dan verwijderd; dit is de zuivering. Na de laatste centrifugatie, aan
zeer hoge snelheid, zal er enkel nog een eiwitmengsel overblijven, geen
celorganellen meer.
De eiwit-oplossing kan worden gescheiden in verschillende fracties door
middel van chromatografie. Er zijn verschillende soorten chromatografieën.
Het verschil tussen de soorten chromatografieën zit in hoe de moleculen
van de mobiele fase interageren met de moleculen van de stationaire fase.
1. Kolomchromatografie
Bij kolomchromatografie bestaat de vaste fase uit een poreuze matrix
waar de mobiele fase doorheen beweegt. De snelheid waarmee de
vloeistof zich doorheen de matrix beweegt is afhankelijk van de
eigenschappen van de vloeistof en van de matrix. Zetmeel kan
bijvoorbeeld gebruikt worden als vaste fase. Zetmeel is een polaire stof,
wat betekent dat de polaire delen van het eiwitmengsel (de eiwitten met
meer polaire aminozuren) trager doorheen de matrix zullen bewegen dan
de apolaire delen. Op die manier ontstaat er verschillende banden,
gescheiden van elkaar door middel van de polariteit. Naarmate de stof
langer doorheen de kolom loopt zullen de banden en de spatie ertussen
verbreden, waarna ze apart kunnen opgevangen worden onderaan de
kolom. Nu zijn er verschillende fracties aan eiwitmengsel gescheiden van
elkaar. Belangrijk om op te merken is dat er geen aparte eiwitten geïsoleerd zijn, maar slechts fracties
met gelijkaardige polariteit.
1
Biochemie 22/23
, 2. Ionenuitwisselingschromatografie
Bij deze chromatografie interageren de geladen eiwitten met een matrix die
bestaat uit een synthetisch polymeer met geladen groepen. Dit kan een matrix
van anionen (kationen uitwisselingschromatografie) of van kationen (anionen
uitwisselingschromatografie) zijn. Als de matrix bijvoorbeeld bestaat uit
negatief geladen deeltjes, zullen de meer positieve eiwitten van het mengsel (de
eiwitten met meer positief geladen aminozuren) trager doorheen de matrix
bewegen dan de negatievere eiwitten. Zo ontstaat er een bandenpatroon aan
de hand van de lading van de eiwitten, en deze banden kunnen weer een voor
een opgevangen worden onderaan de kolom. De lading van eiwitten en dus ook
de scheiding is afhankelijk van de pH van de oplossing.
3. Size-exclusion chromatography (moleculaire-zeef chromatografie)
In deze vorm van chromatografie worden eiwitfracties gescheiden op basis van
hun grootte. De matrix bestaat uit kralen van polymeren met kanaaltjes in waar
de moleculen doorheen bewegen. Kleine eiwitfracties kunnen makkelijker in
die kanaaltjes waardoor het langer duurt om doorheen de kolom te bewegen
omdat ze telkens in en uit de kanaaltjes moeten gaan. Grotere moleculen
bewegen vrijer doorheen de matrix waardoor ze sneller zullen bewegen en er
weer een bandenpatroon zal ontstaan.
4. Affiniteitschromatografie
Hierbij bestaat de matrix uit liganden die specifiek met bepaalde
eiwitten kunnen binden. Een veel gebruikte toepassing van deze
chromatografie is de immuno-affiniteitschromatografie. Hierbij
worden antilichamen gebruikt als ligand: die kunnen zeer
specifiek binden met één bepaald eiwit (deze eiwitten hebben
dus een hoge affiniteit voor dit ligand). Dit eiwit zal blijven
hangen in de kolom terwijl de rest van het eiwitmengsel er
doorheen loopt. Hierna moeten de eiwitten dan weer
losgemaakt worden van het ligand. Dit kan door een mengsel
met hoge zoutconcentratie doorheen de kolom te laten lopen
waardoor de ionaire eiwit-ligand reacties verbroken worden of
door competitie met andere liganden waarmee het eiwit kan
binden zodat het los komt van de matrix en door de kolom kan lopen.
2
Biochemie 22/23
, • Elektroforese
immunoblot uitleggen = typische vraag
Elektroforese is het scheiden van eiwitten in een elektrisch veld.
Omdat de eiwitten een netto lading hebben zullen ze bewegen
doorheen het veld naar de richting van de tegengestelde lading. De
matrix is een cross linked polymeer, bv. polyacrylamide -> PAGE =
polyacrylamide gel electroforese. De matrix is een soort van zeef
waar eiwitten worden gescheden naar hun massa en vorm. De
eiwitten worden behandeld met SDS, een detergentmolecule. Deze
molecule heeft een polaire kop en een apolaire staart. SDS zorgt
ervoor dat eiwitten denatureren waardoor ze allemaal bolvormig
worden en het geeft een uniforme negatieve lading aan de reeds
geladen eiwitten waardoor ze aangetrokken worden door de
positieve pool op basis van hun grootte en niet hun lading, die kan verschillen. Grote eiwitten bewegen
moeilijker doorheen de gel waardoor ze trager zijn dan kleinere eiwitten, zo ontstaat een
bandenpatroon en kunnen de eiwitten geïdentificeerd worden. Eiwitten zijn kleurloos dus er wordt
een kleurstof toegevoegd, bv. Coomassie blue die aan de eiwitten kan binden zodat ze zichtbaar
worden en geïdentificeerd kunnen worden.
Om de massa van het onbekende eiwit te
schatten wordt het vergeleken met merker
eiwitten. Dit zijn eiwitten waarvan de massa al
gekend is, aan de hand hiervan kan gekeken
worden naar waar het onbekende eiwit zich
bevindt tov. de merker eiwitten en kan de massa
geschat worden. De massa van de
merkereiwitten wordt uitgezet in functie van
hoe ver het eiwit heeft bewogen in de gel. Dit is
de relative migration. Hierdoor krijg je een
rechte, en als de bewogen afstand van het
onbekende eiwit gekend is kan adhv. lineaire interpolatie vrij nauwkeurig de massa berekend worden.
Een belangrijk deel van de elektroforese is de tracking dye, bv. broomfenol blauw. Deze kleurstof is
kleiner dan de eiwitten en gaat dus sneller. Aan de hand van de tracking dye kan dus ingeschat worden
hoe ver de snelste eiwitten al gemigreerd zijn zodat de elektroforese op tijd gestopt kan worden zodat
de banden niet in elkaar overgaan.
Isoelectric focusing: Eerst worden de eiwitten onderworpen aan een pH gradiënt. Aan een met gel
gevuld buisje wordt een pH gradiënt aangebracht. De eiwitten worden daarna aan een opening
toegevoegd en er wordt een elektrisch veld over het buisje aangebracht. Net zoals bij PAGE gaan de
eiwitten migreren onder invloed van hun ladingen (AZ). Eens ze bij de pH = PI (iso-elektrisch punt)
aankomen, worden ze neutraal geladen en stoppen ze met bewegen. Nu zijn ze gescheiden op PI.
2D elektroforese: eerst PI dan PAGE. Aangezien de eiwitten na PI neutraal zijn => SDS toevoegen voor
lading.
3
Biochemie 22/23
, Een immunoblot / Western blot is een techniek
waarmee een specifiek eiwit in een mengsel van
eiwitten door middel van antilichamen
gedetecteerd kan worden. Blotting = eiwitten
overbrengen op nitrocellulose membraam.
In de eerste stap wordt het eiwitmengsel door
middel van gel-elektroforese in afzonderlijke
eiwitbanden gescheiden in een dragermatrix
(SDS-PAGE, Native-PAGE, isoelectric focusing, 2D-
gel-elektroforese), afhankelijk van de grootte van
het eiwit, de lading of andere eigenschappen.
De afgescheiden eiwitbanden worden vervolgens
overgebracht van de gel naar een vast
draagmembraan (nitrocellulose) voor de Western
blot. Dit proces wordt blotting genoemd. Daar
worden ze geblokkeerd met melk (= blocking
agent) om niet-specifieke antilichaambinding te
voorkomen, en vervolgens gekleurd met
antilichamen die specifiek zijn voor het doeleiwit.
Het eiwit waarin men geïnteresseerd is kan gedetecteerd worden met een voor dat eiwit specifiek
antilichaam. Om dit specifiek gebonden antilichaam zichtbaar te maken wordt na incubatie met dit
eerste antilichaam de blot behandeld met een tweede antilichaam dat bindt aan het eerste
antilichaam. Dit tweede antilichaam is gelabeld zodat men precies kan zien waar het eerste
antilichaam gebonden heeft en dus waar het eiwit zich bevindt.
4
Biochemie 22/23
