Moleculaire diagnostiek
H1: Kwantitatieve PCR (qPCR)
1.1. Verschil end point PCR en qPCR
End point PCR of conventionele PCR
- Detectie tijdens plateaufase
- = niet kwantitatief
qPCR of real time PCR
- Detectie in real time = elke cyclus wordt hoeveelheid PCR-product gemeten
- = kwantitatief
KENMERKEN QPCR
Na of tijdens elke cyclus PCR-product gemeten
PCR-producten = fluorescerend door binding aan fluorescente kleurstof of probe
Hoeveelheid fluorescentie = evenredig met gevormde PCR-product
VOORDELEN QPRC
PCR-product moet na afloop v reactie niet meer worden geanalyseerd (bvb door
gelelektroforese)
Kwantificering v startmateriaal is mogelijk
Meerdere kleurstoffen fluorescentie kunnen gedetecteerd worden
→ Multiplex toepassingen
1.2. Principe qPCR
Denaturatie: dsDNA → ssDNA
Annealing= primers binden aan complementaire sequentie
Extensie/elongatie: DNA-polymerase synthetiseert nieuwe streng
Intercalerende kleurstof gebruiken voor fluorescentie (SYBR Safe/Green)
Exponentiële amplificatie: na elke cyclus verdubbelt het amplicon: 2… (… = aantal cycli)
1.2.1. Detectie obv fluorescentie
Lichtzenden op fluorochroom met excitatiefilter → naar aangeslagen toestand → terugvallen →
uitzenden emissielicht opvangen in detector met emissiefilter
1
,Moleculaire diagnostiek
1.2.2. Directe qPCR-detectiemethoden
Dmv DNA-intercalerende kleurstoffen
1.2.3. Indirecte qPCR-detectiemethoden
Twee primers + probe
Probe = gelabeld stukje ssDNA, complementair met amplicon
Verschillende soorten probes:
- Hydrolyse probe = dual labelled probe = TaqMan probe
o Fluorochroom + quencher
o Exonuclease activiteit v polymerase (welke?)
HYDROLYSE PROBE (TAQMAN)
5’-kant = reporter
3’-kant = quencher, heeft inhiberend effect op reporter
Taq-polymerase heeft 5’-3’ exonnucleasefunctie → knipt probe kapot
Fluofoor gescheiden v quencher → fluorescentie
Fluorescentie = evenredig met hoeveelheid PCR-product
MOLECULAR BEACON PROBE
Haarspeld-vormige DNA-probe met:
5’-kant = reporter
3’-kant = quencher
Complementaire sequentie binnen zelfde probe → daardoor vorming hairpin
In gesloten vorm = geen fluorescentie, want reporter en quencher naast elkaar
Als probe bindt aan complementaire doel-DNA → opent hairpin → probe hybridiseert met target
- Er moet 100% overeenkomst zijn, anders geen binding
R en Q uit elkaar → fluorescentie
Polymerase breekt hier probe NIET af!
2
,Moleculaire diagnostiek
Zeer specifiek
Multiplex-toepassingen en multi-analyse
MULTIPLEX-QPCR
Conventionele PCR: verschillende fragmentlengtes zoeken
qPCR: probes met verschillende fluorochromen
Spectrale overlap:
- = emissiespectra v twee fluorochromen deels overlappen → fluo-signaal niet goed
scheiden
- Oplossing: fluorochromen met ruim gescheiden excitatie/emissiepiek kiezen
GENOTYPEREN MET MOLECULAR BEACONS
Zeer specifieke probes
Speciaal ontwikkeld voor SNV-analyse (single nucleotide variant)
Geen signaal indien geen 100% overeenkomst met target DNA
VOORBEELD
2 fluorochromen
- Groen: bindt aan wildtype sequentie
- Rood: bindt aan mutante sequentie
1 qPCR met beide probes uitvoeren
Homozygoot wildtype (links)
- Groene probe matcht perfect met wildtype → binden + opengetrokken → fluo
- Rode probe geen match → bindt niet → geen fluo
- Grafiek: groene curve stijgt → want fluo v wildtype probe gedecteerd
Heterozygoot
- 1 wildtype allel → binding → fluo
- 1 mutant allel → binding → fluo
- Grafiek: rode en groene curve stijgen even
hoog (beide evenveel aanwezig)
Homozygoot mutant
- Rode probe → binding → fluo
- Groene probe → geen binding → geen fluo
- Grafiek: rode curve stijgt
3
, Moleculaire diagnostiek
1.3. Detectie, analyse en kwantificering qPCR-producten
1.3.1. Drempelwaarde en Cq
Drempelwaarde of treshold = signaal duidelijk boven achtergrondruis uitstijgt
Cq (quantification cycle) = bepalen adhv treshold, waarde
- = PCR-cyclus waarop fluorescentie van staal de treshold overschrijdt
RFU = relative fluoresence units = fluorescentie-intensiteit
Hoe kleiner Cq, hoe meer target DNA er is
- minder cycli nodig om detecteerbaar te zijn dan hoge Cq
Hoe groter Cq, hoe minder target DNA er is
1.3.2. Efficiëntie qPCR
VOORBEELD
Verschil in Cq:
- Bvb. = 1
o Dan verschil in concentratie is dubbel zo groot
o Stel A = 22 en B = 23
o B heeft 1 cyclus later drempel v A brereikt
o Elke cyclus = verdubbeling → B halve starthoeveelheid start-DNA vgl A
▪ 2^1 = 2
- Bvb. = 3.25
o Stel A = 22 en B = 25.25
o B heeft 3.25 cyclussen later dan A drempel bereikt
o 2^3.25 = 9.51 → A had 9.51x meer start-DNA als B
Enkel indien je weet dat efficiëntie 100% was
EFFICIËNTIE AFHANKELIJK VAN
- Remmende stoffen
- Lengte target
- Secundaire structuren vh target (hairpins)
- Beschikbare PCR-componenten
4
H1: Kwantitatieve PCR (qPCR)
1.1. Verschil end point PCR en qPCR
End point PCR of conventionele PCR
- Detectie tijdens plateaufase
- = niet kwantitatief
qPCR of real time PCR
- Detectie in real time = elke cyclus wordt hoeveelheid PCR-product gemeten
- = kwantitatief
KENMERKEN QPCR
Na of tijdens elke cyclus PCR-product gemeten
PCR-producten = fluorescerend door binding aan fluorescente kleurstof of probe
Hoeveelheid fluorescentie = evenredig met gevormde PCR-product
VOORDELEN QPRC
PCR-product moet na afloop v reactie niet meer worden geanalyseerd (bvb door
gelelektroforese)
Kwantificering v startmateriaal is mogelijk
Meerdere kleurstoffen fluorescentie kunnen gedetecteerd worden
→ Multiplex toepassingen
1.2. Principe qPCR
Denaturatie: dsDNA → ssDNA
Annealing= primers binden aan complementaire sequentie
Extensie/elongatie: DNA-polymerase synthetiseert nieuwe streng
Intercalerende kleurstof gebruiken voor fluorescentie (SYBR Safe/Green)
Exponentiële amplificatie: na elke cyclus verdubbelt het amplicon: 2… (… = aantal cycli)
1.2.1. Detectie obv fluorescentie
Lichtzenden op fluorochroom met excitatiefilter → naar aangeslagen toestand → terugvallen →
uitzenden emissielicht opvangen in detector met emissiefilter
1
,Moleculaire diagnostiek
1.2.2. Directe qPCR-detectiemethoden
Dmv DNA-intercalerende kleurstoffen
1.2.3. Indirecte qPCR-detectiemethoden
Twee primers + probe
Probe = gelabeld stukje ssDNA, complementair met amplicon
Verschillende soorten probes:
- Hydrolyse probe = dual labelled probe = TaqMan probe
o Fluorochroom + quencher
o Exonuclease activiteit v polymerase (welke?)
HYDROLYSE PROBE (TAQMAN)
5’-kant = reporter
3’-kant = quencher, heeft inhiberend effect op reporter
Taq-polymerase heeft 5’-3’ exonnucleasefunctie → knipt probe kapot
Fluofoor gescheiden v quencher → fluorescentie
Fluorescentie = evenredig met hoeveelheid PCR-product
MOLECULAR BEACON PROBE
Haarspeld-vormige DNA-probe met:
5’-kant = reporter
3’-kant = quencher
Complementaire sequentie binnen zelfde probe → daardoor vorming hairpin
In gesloten vorm = geen fluorescentie, want reporter en quencher naast elkaar
Als probe bindt aan complementaire doel-DNA → opent hairpin → probe hybridiseert met target
- Er moet 100% overeenkomst zijn, anders geen binding
R en Q uit elkaar → fluorescentie
Polymerase breekt hier probe NIET af!
2
,Moleculaire diagnostiek
Zeer specifiek
Multiplex-toepassingen en multi-analyse
MULTIPLEX-QPCR
Conventionele PCR: verschillende fragmentlengtes zoeken
qPCR: probes met verschillende fluorochromen
Spectrale overlap:
- = emissiespectra v twee fluorochromen deels overlappen → fluo-signaal niet goed
scheiden
- Oplossing: fluorochromen met ruim gescheiden excitatie/emissiepiek kiezen
GENOTYPEREN MET MOLECULAR BEACONS
Zeer specifieke probes
Speciaal ontwikkeld voor SNV-analyse (single nucleotide variant)
Geen signaal indien geen 100% overeenkomst met target DNA
VOORBEELD
2 fluorochromen
- Groen: bindt aan wildtype sequentie
- Rood: bindt aan mutante sequentie
1 qPCR met beide probes uitvoeren
Homozygoot wildtype (links)
- Groene probe matcht perfect met wildtype → binden + opengetrokken → fluo
- Rode probe geen match → bindt niet → geen fluo
- Grafiek: groene curve stijgt → want fluo v wildtype probe gedecteerd
Heterozygoot
- 1 wildtype allel → binding → fluo
- 1 mutant allel → binding → fluo
- Grafiek: rode en groene curve stijgen even
hoog (beide evenveel aanwezig)
Homozygoot mutant
- Rode probe → binding → fluo
- Groene probe → geen binding → geen fluo
- Grafiek: rode curve stijgt
3
, Moleculaire diagnostiek
1.3. Detectie, analyse en kwantificering qPCR-producten
1.3.1. Drempelwaarde en Cq
Drempelwaarde of treshold = signaal duidelijk boven achtergrondruis uitstijgt
Cq (quantification cycle) = bepalen adhv treshold, waarde
- = PCR-cyclus waarop fluorescentie van staal de treshold overschrijdt
RFU = relative fluoresence units = fluorescentie-intensiteit
Hoe kleiner Cq, hoe meer target DNA er is
- minder cycli nodig om detecteerbaar te zijn dan hoge Cq
Hoe groter Cq, hoe minder target DNA er is
1.3.2. Efficiëntie qPCR
VOORBEELD
Verschil in Cq:
- Bvb. = 1
o Dan verschil in concentratie is dubbel zo groot
o Stel A = 22 en B = 23
o B heeft 1 cyclus later drempel v A brereikt
o Elke cyclus = verdubbeling → B halve starthoeveelheid start-DNA vgl A
▪ 2^1 = 2
- Bvb. = 3.25
o Stel A = 22 en B = 25.25
o B heeft 3.25 cyclussen later dan A drempel bereikt
o 2^3.25 = 9.51 → A had 9.51x meer start-DNA als B
Enkel indien je weet dat efficiëntie 100% was
EFFICIËNTIE AFHANKELIJK VAN
- Remmende stoffen
- Lengte target
- Secundaire structuren vh target (hairpins)
- Beschikbare PCR-componenten
4
