Methoden in het biomedisch onderzoek 3 2024-2025
Inleiding
Multi-omics
DNA Genomics 3 miljard basen – 20 000 genen
>> next generation sequencing
RNA Transcriptomics +/- 40 000 transcripten
>> microarrays / RNAseq
Eiwitten Proteomics > 100 000 eiwitten
>> massa spectrometrie
Metabolieten Metabolomics > 100 000 metabolieten
>> massa spectrometrie / NMR
DNA
= drager van genetische informatie
DNA sequentiebepaling
Evolutie in methoden (sequentiebepaling = volgorde DNA aflezen)
First generation sequencing
- Sanger, (Maxam and Gilbert)
- Kloneren (plasmiden – bacteriën)
- Elektroforese
- Nog steeds “gouden standaard”, voor kleine projecten
- Verschillende lengtes scheiden obv groottes mbv elektroforese
- Nadeel: 1 sequentie tegelijk (traag, veel machines en wetenschappers nodig, duur)
Second-generation sequencing (= next-generation sequencing)
- Massief parallel (= miljoenen korte sequenties tegelijk) sequencen van klonaal in
vitro geamplificeerde DNA-moleculen
- Bv. Illumina, Ion Torrent
- Deze methode is veel sneller en goedkoper dan de eerste generatie, en geschikt voor
grootschalige toepassingen zoals genoomanalyse.
- Korte sequenties
1
,Methoden in het biomedisch onderzoek 3 2024-2025
Third-generation sequencing (= next-next generation sequencing)
- Sequencing van individuele DNA-moleculen (single molecule) (geen amplificatie =>
bespaart kosten, gaat sneller)
- Bv. Nanopore, Pacific Biosciences
- Bovendien kunnen deze technieken veel langere DNA-fragmenten in één keer lezen,
wat gunstig is voor complexe genoomanalyses.
Brede toepassingen
De novo genoom sequentiebepaling
- Ongekende genomen
- Bv. Humaan Genoom Project
- Nieuwe organismen (bv. Sars-CoV-2)
- Gedeeltelijk of volledig
Resequencing
- Individuen tov referentiegenoom
à Zijn nieuwe individuen van
eenzelfde species waarvan we
al een referentiegenoom hebben
- Verschillen tussen individuen
(SNPs)
- Mutaties (ziekten)
- Construct verificatie
- Klinische toepassingen:
diagnose, farmacogenetica,
NIPT …
Sequentiebepaling als teller
- Aantallen DNA (of RNA)
moleculen
- (zie RNAseq, ChIPseq …)
2
,Methoden in het biomedisch onderzoek 3 2024-2025
De novo sequencing is moeilijker dan resequencing
à Je hebt allemaal verschillende stukjes die geassembleerd moeten w
à Alle stukjes hebben een beetje overlap
à Adhv die overlap moet je proberen al die stukjes aan elkaar te hangen
à Owv repetitieve sequenties zijn er vaak meerdere mogelijkheden
à Moeilijke puzzel
Eens je het referentiegenoom hebt, w het makkelijker (resequencing)
à Gewoon nieuwe sequenties mappen op referentiegenoom
à Veel eenvoudiger
à Kan gebruikt w om verschillende sequenties van individuen met elkaar te vergelijken
Sequentiebepaling ook gebruikt als teller
à Bv om transcriptomics te doen via RNAseq
à Sequentiebepaling doen, niet om de sequentie te kennen, maar om transcript te
kunnen identificeren
à Kijken hoe vaak je datzelfde transcript tegenkomt => aantal transcripten v een
bepaald gen tellen
3
, Methoden in het biomedisch onderzoek 3 2024-2025
De novo sequencing vs resequencing
Whole genome, exome en targeted sequencing
- WGS = whole-genome sequencing
- WES = whole-exome sequencing
= coderende sequentie
= 1,5% van genoom
à Als je de exonen gaat sequencen, heb je alle informatie die je nodig hebt (je bent
niet geïnteresseerd in mutaties in alle introns en niet-coderende sequenties, dus
logisch dat je niet een heel genoom gaat sequencen)
à Reduceert tijd en kosten en je hebt toch de relevante informatie
- Targeted sequencing = specifiek gewenste regio’s
- Transcriptoom: RNA à cDNA
4
Inleiding
Multi-omics
DNA Genomics 3 miljard basen – 20 000 genen
>> next generation sequencing
RNA Transcriptomics +/- 40 000 transcripten
>> microarrays / RNAseq
Eiwitten Proteomics > 100 000 eiwitten
>> massa spectrometrie
Metabolieten Metabolomics > 100 000 metabolieten
>> massa spectrometrie / NMR
DNA
= drager van genetische informatie
DNA sequentiebepaling
Evolutie in methoden (sequentiebepaling = volgorde DNA aflezen)
First generation sequencing
- Sanger, (Maxam and Gilbert)
- Kloneren (plasmiden – bacteriën)
- Elektroforese
- Nog steeds “gouden standaard”, voor kleine projecten
- Verschillende lengtes scheiden obv groottes mbv elektroforese
- Nadeel: 1 sequentie tegelijk (traag, veel machines en wetenschappers nodig, duur)
Second-generation sequencing (= next-generation sequencing)
- Massief parallel (= miljoenen korte sequenties tegelijk) sequencen van klonaal in
vitro geamplificeerde DNA-moleculen
- Bv. Illumina, Ion Torrent
- Deze methode is veel sneller en goedkoper dan de eerste generatie, en geschikt voor
grootschalige toepassingen zoals genoomanalyse.
- Korte sequenties
1
,Methoden in het biomedisch onderzoek 3 2024-2025
Third-generation sequencing (= next-next generation sequencing)
- Sequencing van individuele DNA-moleculen (single molecule) (geen amplificatie =>
bespaart kosten, gaat sneller)
- Bv. Nanopore, Pacific Biosciences
- Bovendien kunnen deze technieken veel langere DNA-fragmenten in één keer lezen,
wat gunstig is voor complexe genoomanalyses.
Brede toepassingen
De novo genoom sequentiebepaling
- Ongekende genomen
- Bv. Humaan Genoom Project
- Nieuwe organismen (bv. Sars-CoV-2)
- Gedeeltelijk of volledig
Resequencing
- Individuen tov referentiegenoom
à Zijn nieuwe individuen van
eenzelfde species waarvan we
al een referentiegenoom hebben
- Verschillen tussen individuen
(SNPs)
- Mutaties (ziekten)
- Construct verificatie
- Klinische toepassingen:
diagnose, farmacogenetica,
NIPT …
Sequentiebepaling als teller
- Aantallen DNA (of RNA)
moleculen
- (zie RNAseq, ChIPseq …)
2
,Methoden in het biomedisch onderzoek 3 2024-2025
De novo sequencing is moeilijker dan resequencing
à Je hebt allemaal verschillende stukjes die geassembleerd moeten w
à Alle stukjes hebben een beetje overlap
à Adhv die overlap moet je proberen al die stukjes aan elkaar te hangen
à Owv repetitieve sequenties zijn er vaak meerdere mogelijkheden
à Moeilijke puzzel
Eens je het referentiegenoom hebt, w het makkelijker (resequencing)
à Gewoon nieuwe sequenties mappen op referentiegenoom
à Veel eenvoudiger
à Kan gebruikt w om verschillende sequenties van individuen met elkaar te vergelijken
Sequentiebepaling ook gebruikt als teller
à Bv om transcriptomics te doen via RNAseq
à Sequentiebepaling doen, niet om de sequentie te kennen, maar om transcript te
kunnen identificeren
à Kijken hoe vaak je datzelfde transcript tegenkomt => aantal transcripten v een
bepaald gen tellen
3
, Methoden in het biomedisch onderzoek 3 2024-2025
De novo sequencing vs resequencing
Whole genome, exome en targeted sequencing
- WGS = whole-genome sequencing
- WES = whole-exome sequencing
= coderende sequentie
= 1,5% van genoom
à Als je de exonen gaat sequencen, heb je alle informatie die je nodig hebt (je bent
niet geïnteresseerd in mutaties in alle introns en niet-coderende sequenties, dus
logisch dat je niet een heel genoom gaat sequencen)
à Reduceert tijd en kosten en je hebt toch de relevante informatie
- Targeted sequencing = specifiek gewenste regio’s
- Transcriptoom: RNA à cDNA
4
