Het effect van etoposide op Jurkat
cellen aan tonen met behulp van de
FACS en MGG-kleuring assays
Namen: -
Datum (inleveren): 10-12-2019
Docent: -
Thema: Celbiologie en Immunochemie
Module: CBO
Werkplan 1e gelegenheid
,Inhoudsopgave
Inhoudsopgave....................................................................................................................... 2
Inleiding.................................................................................................................................. 3
Onderzoeksvraag................................................................................................................3
Proefopzet.......................................................................................................................... 3
Hypothese........................................................................................................................... 3
Tijdsplanning....................................................................................................................... 4
Praktijk 1................................................................................................................................. 5
Celkweek............................................................................................................................ 5
Levend/dood telling met trypaanblauw................................................................................7
Praktijk 2................................................................................................................................. 8
FACS.................................................................................................................................. 8
Praktijk 3............................................................................................................................... 10
Cytospins maken.............................................................................................................. 10
Cytospins kleuren met MGG.............................................................................................11
Bijlage.................................................................................................................................. 12
Meten van cellen met behulp van Guave Soft 3.1.1..........................................................12
Risicoanalyse.................................................................................................................... 14
Praktijk 1....................................................................................................................... 14
Praktijk 3....................................................................................................................... 15
Vragen werkcollege.......................................................................................................... 17
2
, Inleiding
Onderzoeksvraag
Het onderzoeksvraag en deelvraag voor dit onderzoek luidt als volgt:
“Kan het effect van etoposide worden aangetoond in Jurkat cellen met behulp van de FACS
en MGG-kleuring assays?”
“Welke van de gebruikte techniek toont het beste het effect van etoposide aan?”
Proefopzet
In dit onderzoek wordt gebruik gemaakt van Jurkat cellen wat een onsterfelijke cellijn van
menselijke T-lymfocyten is. Het effect van etoposide wordt onderzocht door twee
technieken. Eerst wordt er voorafgaand een celkweek uitgevoerd. Er wordt een mix gemaakt
met Jurkat cellen en etoposide opgelost in DMSO. Als negatieve controle worden alleen de
Jurkat cellen in de DMSO opgelost om het mogelijke effect van DMSO op de cellen uit te
sluiten.
Vervolgens wordt de FACS assay ingezet. FACS in gebaseerd op immunologische
eigenschappen en wordt uitgevoerd met de antilichamen Annexin αV-FITC en αPI. Annexin
V bindt specifiek aan fosfatidylserine, dit komt vrij bij cellen die in apoptose zitten. FITC
veroorzaakt hierbij de groene fluorescentie. Propidium iodide (αPI) is een fluorescente stof
die niet door het celmembraan heen kan waardoor alleen de necrotische cellen worden
aangekleurd. Necrotische cellen zijn cellen waarbij het celmembraan kapot is waarbij de
inhoud vrijkomt. Apoptose cellen is (zie figuur onderin). Hierna worden de cellen gemeten
door een laser met behulp van de fluorescentie die van de necrotische cellen afkomt.
Daarna wordt de MGG-kleuring ingezet. Eerst wordt er een cytospin uitgevoerd waar de
cellen worden gecentrifugeerd en op een glaasje worden geplaatst. Het glaasje met de
cellen wordt vervolgens gekleurd met MGG zodat ze onder een lichtmicroscoop met behulp
van een Bürker Telkamer geteld kunnen worden. Hierbij wordt er gekeken naar de vorm wat
normale cellen van cellen in apoptose cellen onderscheiden.
Hypothese
Aangezien etoposide de celdeling remt wordt er verwacht dat er bij zowel de FACS assay
als de MGG-kleuring assay wordt aangetoond dat er inderdaad minder cellen zullen zijn bij
de monsters die met etoposide zijn behandeld dan bij de controles. Daarnaast is de
verwachting dat de FACS assay beter resultaat zal geven omdat het een snelle en effectieve
manier is om cellen te analyseren.
3
cellen aan tonen met behulp van de
FACS en MGG-kleuring assays
Namen: -
Datum (inleveren): 10-12-2019
Docent: -
Thema: Celbiologie en Immunochemie
Module: CBO
Werkplan 1e gelegenheid
,Inhoudsopgave
Inhoudsopgave....................................................................................................................... 2
Inleiding.................................................................................................................................. 3
Onderzoeksvraag................................................................................................................3
Proefopzet.......................................................................................................................... 3
Hypothese........................................................................................................................... 3
Tijdsplanning....................................................................................................................... 4
Praktijk 1................................................................................................................................. 5
Celkweek............................................................................................................................ 5
Levend/dood telling met trypaanblauw................................................................................7
Praktijk 2................................................................................................................................. 8
FACS.................................................................................................................................. 8
Praktijk 3............................................................................................................................... 10
Cytospins maken.............................................................................................................. 10
Cytospins kleuren met MGG.............................................................................................11
Bijlage.................................................................................................................................. 12
Meten van cellen met behulp van Guave Soft 3.1.1..........................................................12
Risicoanalyse.................................................................................................................... 14
Praktijk 1....................................................................................................................... 14
Praktijk 3....................................................................................................................... 15
Vragen werkcollege.......................................................................................................... 17
2
, Inleiding
Onderzoeksvraag
Het onderzoeksvraag en deelvraag voor dit onderzoek luidt als volgt:
“Kan het effect van etoposide worden aangetoond in Jurkat cellen met behulp van de FACS
en MGG-kleuring assays?”
“Welke van de gebruikte techniek toont het beste het effect van etoposide aan?”
Proefopzet
In dit onderzoek wordt gebruik gemaakt van Jurkat cellen wat een onsterfelijke cellijn van
menselijke T-lymfocyten is. Het effect van etoposide wordt onderzocht door twee
technieken. Eerst wordt er voorafgaand een celkweek uitgevoerd. Er wordt een mix gemaakt
met Jurkat cellen en etoposide opgelost in DMSO. Als negatieve controle worden alleen de
Jurkat cellen in de DMSO opgelost om het mogelijke effect van DMSO op de cellen uit te
sluiten.
Vervolgens wordt de FACS assay ingezet. FACS in gebaseerd op immunologische
eigenschappen en wordt uitgevoerd met de antilichamen Annexin αV-FITC en αPI. Annexin
V bindt specifiek aan fosfatidylserine, dit komt vrij bij cellen die in apoptose zitten. FITC
veroorzaakt hierbij de groene fluorescentie. Propidium iodide (αPI) is een fluorescente stof
die niet door het celmembraan heen kan waardoor alleen de necrotische cellen worden
aangekleurd. Necrotische cellen zijn cellen waarbij het celmembraan kapot is waarbij de
inhoud vrijkomt. Apoptose cellen is (zie figuur onderin). Hierna worden de cellen gemeten
door een laser met behulp van de fluorescentie die van de necrotische cellen afkomt.
Daarna wordt de MGG-kleuring ingezet. Eerst wordt er een cytospin uitgevoerd waar de
cellen worden gecentrifugeerd en op een glaasje worden geplaatst. Het glaasje met de
cellen wordt vervolgens gekleurd met MGG zodat ze onder een lichtmicroscoop met behulp
van een Bürker Telkamer geteld kunnen worden. Hierbij wordt er gekeken naar de vorm wat
normale cellen van cellen in apoptose cellen onderscheiden.
Hypothese
Aangezien etoposide de celdeling remt wordt er verwacht dat er bij zowel de FACS assay
als de MGG-kleuring assay wordt aangetoond dat er inderdaad minder cellen zullen zijn bij
de monsters die met etoposide zijn behandeld dan bij de controles. Daarnaast is de
verwachting dat de FACS assay beter resultaat zal geven omdat het een snelle en effectieve
manier is om cellen te analyseren.
3
