Samenvatting thema 3
Inhoudsopgave
Analyse.......................................................................................................................................................... 1
UV-Vis...................................................................................................................................................................1
HPLC chromatografie............................................................................................................................................2
Proteomics en massaspectrometrie............................................................................................................... 4
Proteomics............................................................................................................................................................4
HPLC......................................................................................................................................................................5
SCX chromatografie..............................................................................................................................................6
RPLC......................................................................................................................................................................6
Massaspectrometrie analyse................................................................................................................................7
Q-TOF....................................................................................................................................................................8
MS/MS analyse.....................................................................................................................................................9
Opbouw van een massaspectrum........................................................................................................................9
Proteomics en bioinformatica........................................................................................................................ 9
Flow Cytometry........................................................................................................................................... 10
Labprotocol Ebo et al................................................................................................................................... 15
Bioanalyse................................................................................................................................................... 16
Labbuddy practicum...........................................................................................................................................18
Analyse
UV-Vis
UV-Vis bij deze methode wordt gebruik gemaakt van een deel van het ultraviolet en het
zichtbare deel van het spectrum, dit deel loopt ongeveer van 200 nm tot 800 nm.
Het licht wordt gebruikt om concentraties van stoffen te meten. De optimale golflengte is
afhankelijk van de structuur van een molecuul. Het spectrum wat uiteindelijk ontstaat is uniek
voor het soort molecuul.
Hieronder is het UV-spectrum van paracetamol weergegeven:
,De hoogte van de piek is afhankelijk van de concentratie die van een stof. De plaats van de
piek is afhankelijk van de structuur van de stof. Hoe meer dubbele bindingen, hoe verder de
piek naar rechts schuift. Bij 200 nm worden de enkele bindingen weergegeven, hier kun je
niet zo veel zinnigs uit halen.
De stippellijn geeft aan dat de piek verschuift als de pH hoger wordt. De OH groep krijgt
namelijk een negatieve lading als de H afgestoten wordt. Dit heeft vervolgens effect op de
absorptie van de benzeenring.
I0 = intensiteit op t=0
I = intensiteit na absorptie
l = lengte van de cuvet
c = concentratie
T = transmissie (ligt altijd tussen 0 en 1)
Het verband tussen transmissie en concentratie is niet lineair. Echter het verband tussen
absorptie en concentratie is wel lineair. De absorptie kan berekend worden door de -log van
de transmissie uit te rekenen.
Wet van Lambert-Beer:
Epsilon = Molaire extinctie coëfficiënt
C = Concentratie in mol/L
L = weglente in cm (meestal 1 cm)
Alternatieve wet van Lambert-Beer:
C = concentratie in g/100 mL
E1 (of A1) = specifieke extinctie
Als je, bij benadering, weet wat de specifieke extinctie is dan kun je bedenken wat ongeveer
de concentratie is waarbij er absorptie plaats zal gaan vinden.
HPLC chromatografie
HPLC (reversed phase chromatogratie) scheiden van stoffen door de verschillende
verdeling van stoffen tussen de mobiele en stationaire fase.
, Stationaire fase roestvrijstalen buisje met silicabolletjes.
Mobiele fase combinatie van oplosmiddelen die onder hoge druk door de
stationaire fase gestuwd.
1. Pomp
2. Injector
3. Kolom
4. Detector
Als stationaire fase worden vaak silicabolletjes gebruikt.
Voordelen silica:
Goed te vormen in bolletjes
Nadeel:
Heel polair. Het karakter van de silica kan veranderd worden door chemische
modificatie van het silicaoppervlak. Een voorbeeld is Silica-C18, hierbij zitten er
C18 groepen aan de OH groepen van de silica.
De scheiding kan beïnvloed door de mobiele fase meer of minder polair te maken. De
polariteit van de mobiele fase kan variëren door het te mengen met organisch oplosmiddel
(bijv. methanol).
Baseline rechte horizontale lijn, deze geeft de constante ‘ruis’ van de stationaire fase weer.
Elke piek in het chromatogram is specifiek voor een bepaalde stof.
Retentietijd = tr de tijd waarop een bepaalde stof gedetecteerd wordt door de detector.
Deze waarde wordt gebruikt om een stof te identificeren.
Gehalte bepaling door middel van HPLC de meetwaarde is gecorreleerd aan de
hoeveelheid stof. De oppervlakte van de piek (A) wordt gebruikt om een stof te kwantificeren.
Inhoudsopgave
Analyse.......................................................................................................................................................... 1
UV-Vis...................................................................................................................................................................1
HPLC chromatografie............................................................................................................................................2
Proteomics en massaspectrometrie............................................................................................................... 4
Proteomics............................................................................................................................................................4
HPLC......................................................................................................................................................................5
SCX chromatografie..............................................................................................................................................6
RPLC......................................................................................................................................................................6
Massaspectrometrie analyse................................................................................................................................7
Q-TOF....................................................................................................................................................................8
MS/MS analyse.....................................................................................................................................................9
Opbouw van een massaspectrum........................................................................................................................9
Proteomics en bioinformatica........................................................................................................................ 9
Flow Cytometry........................................................................................................................................... 10
Labprotocol Ebo et al................................................................................................................................... 15
Bioanalyse................................................................................................................................................... 16
Labbuddy practicum...........................................................................................................................................18
Analyse
UV-Vis
UV-Vis bij deze methode wordt gebruik gemaakt van een deel van het ultraviolet en het
zichtbare deel van het spectrum, dit deel loopt ongeveer van 200 nm tot 800 nm.
Het licht wordt gebruikt om concentraties van stoffen te meten. De optimale golflengte is
afhankelijk van de structuur van een molecuul. Het spectrum wat uiteindelijk ontstaat is uniek
voor het soort molecuul.
Hieronder is het UV-spectrum van paracetamol weergegeven:
,De hoogte van de piek is afhankelijk van de concentratie die van een stof. De plaats van de
piek is afhankelijk van de structuur van de stof. Hoe meer dubbele bindingen, hoe verder de
piek naar rechts schuift. Bij 200 nm worden de enkele bindingen weergegeven, hier kun je
niet zo veel zinnigs uit halen.
De stippellijn geeft aan dat de piek verschuift als de pH hoger wordt. De OH groep krijgt
namelijk een negatieve lading als de H afgestoten wordt. Dit heeft vervolgens effect op de
absorptie van de benzeenring.
I0 = intensiteit op t=0
I = intensiteit na absorptie
l = lengte van de cuvet
c = concentratie
T = transmissie (ligt altijd tussen 0 en 1)
Het verband tussen transmissie en concentratie is niet lineair. Echter het verband tussen
absorptie en concentratie is wel lineair. De absorptie kan berekend worden door de -log van
de transmissie uit te rekenen.
Wet van Lambert-Beer:
Epsilon = Molaire extinctie coëfficiënt
C = Concentratie in mol/L
L = weglente in cm (meestal 1 cm)
Alternatieve wet van Lambert-Beer:
C = concentratie in g/100 mL
E1 (of A1) = specifieke extinctie
Als je, bij benadering, weet wat de specifieke extinctie is dan kun je bedenken wat ongeveer
de concentratie is waarbij er absorptie plaats zal gaan vinden.
HPLC chromatografie
HPLC (reversed phase chromatogratie) scheiden van stoffen door de verschillende
verdeling van stoffen tussen de mobiele en stationaire fase.
, Stationaire fase roestvrijstalen buisje met silicabolletjes.
Mobiele fase combinatie van oplosmiddelen die onder hoge druk door de
stationaire fase gestuwd.
1. Pomp
2. Injector
3. Kolom
4. Detector
Als stationaire fase worden vaak silicabolletjes gebruikt.
Voordelen silica:
Goed te vormen in bolletjes
Nadeel:
Heel polair. Het karakter van de silica kan veranderd worden door chemische
modificatie van het silicaoppervlak. Een voorbeeld is Silica-C18, hierbij zitten er
C18 groepen aan de OH groepen van de silica.
De scheiding kan beïnvloed door de mobiele fase meer of minder polair te maken. De
polariteit van de mobiele fase kan variëren door het te mengen met organisch oplosmiddel
(bijv. methanol).
Baseline rechte horizontale lijn, deze geeft de constante ‘ruis’ van de stationaire fase weer.
Elke piek in het chromatogram is specifiek voor een bepaalde stof.
Retentietijd = tr de tijd waarop een bepaalde stof gedetecteerd wordt door de detector.
Deze waarde wordt gebruikt om een stof te identificeren.
Gehalte bepaling door middel van HPLC de meetwaarde is gecorreleerd aan de
hoeveelheid stof. De oppervlakte van de piek (A) wordt gebruikt om een stof te kwantificeren.
