Molecular Biology of the Cell – Hoofdstuk 9
Een typische dierlijke cel is 10-20 um in diameter. In 1838 werden de eerste cellen pas gezien en
stelde Schleiden en Schwann de cel doctine op. Omdat cellen normaal doorzichtig zijn, zijn
technieken voor het voorbereiden van de sample minstens even belangrijk als de microscopen zelf.
De eerste 100 jaar was de microscoop niet in staat structurele details te geven van iets wat kleiner is
dan de eigen golflengte. Voor de (vroege) licht microscoop zou dit 0.4 tot 0.7 um zijn, waardoor een
bacterie (0.5 um) net zichtbaar is.
Omdat licht golven met elkaar interacteren is er sprake van optical diffraction. Hierdoor krijg je
complexe patronen als licht wegkaatst van voorwerpen/oppervlakten
- Als twee golven precies in fase ergens aan komen versterken ze elkaar en krijg je zo een
hogere helderheid.
- Als twee golven niet in fase aankomen interfereren ze met elkaar en verdwijnen ze (deels).
Door de beperkingen van licht zijn beelden vaag en overlappen ze vaak.
Limit of resolution: de limiet van scheiding waarop twee objecten apart te zien zijn.
- De limit of resolution is afhankelijk van de golflengte van het licht en de numerical aperture
van het lenssysteem.
o De numerical aperture beschrijft het vermogen van de lens om licht op te vangen en
is afhankelijk van de hoek waarop de microscoop het licht opvangt en de refractive
index medium van de lens.
o De refractive index van het medium is de ratio van de snelheid van licht in vacuüm
tegenover de snelheid in het medium.
Er is een verschil tussen resolutie en detectie. Ook als een element veel kleiner is dan de resolutie kan
je het nogsteeds detecteerbaar maken door bijvoorbeeld fluorescerende labeling.
Elke afbeelding (optisch of electrisch) wordt gemaakt door deeltjes zoals fotonen. Echter door
kwantummechanica is er altijd een niet te voorspellen locatie. Daarnaast is er ook altijd een
achtergrond ruis. Als er minder onderdelen zijn in sample is er altijd en groter effect van de
willekeurigheid van de partikels, en krijg je dus een minder nauwkeurig beeld.
Bright field microscope: licht dat door een celculture valt vormt het beeld.
Dark field microscope: alleen het weerkaatste licht wordt opgevangen waardoor je een wit beeld op
een zwarte achtergrond krijgt.
Phase contrast microscope: afhankelijk van de dichtheid van bepaalde celonderdelen beweegt licht
sneller of langzamer (refractive index). Dit wordt verstekt door deze microscoop zodat je een meer
overdreven beeld krijgt van de celstructuren (wordt ook toegepast bij differential-interference-
contrast microscope).
Bij alle drie deze technieken is het mogelijk om naar bewegingen en cel processen te kijken.
Door electronic imaging systems worden twee imperfecties van het menselijke oog omzeild: we
kunnen namelijk niet goed zien in condities van weinig licht, en we zien weinig verschil in condities
met enorm veel achtergrond licht. Afbeelding sensoren (CCD of CMOS) kunnen worden toegevoegd
aan licht microscopen en zijn tot wel 10x meer gevoelig dan menselijke ogen. Hierdoor kunnen we
over lange tijd kijken naar condities met weinig licht. Ook kan door afbeelding bewerking problemen
in contrast en achtergrond waas verholpen worden.
Een typische dierlijke cel is 10-20 um in diameter. In 1838 werden de eerste cellen pas gezien en
stelde Schleiden en Schwann de cel doctine op. Omdat cellen normaal doorzichtig zijn, zijn
technieken voor het voorbereiden van de sample minstens even belangrijk als de microscopen zelf.
De eerste 100 jaar was de microscoop niet in staat structurele details te geven van iets wat kleiner is
dan de eigen golflengte. Voor de (vroege) licht microscoop zou dit 0.4 tot 0.7 um zijn, waardoor een
bacterie (0.5 um) net zichtbaar is.
Omdat licht golven met elkaar interacteren is er sprake van optical diffraction. Hierdoor krijg je
complexe patronen als licht wegkaatst van voorwerpen/oppervlakten
- Als twee golven precies in fase ergens aan komen versterken ze elkaar en krijg je zo een
hogere helderheid.
- Als twee golven niet in fase aankomen interfereren ze met elkaar en verdwijnen ze (deels).
Door de beperkingen van licht zijn beelden vaag en overlappen ze vaak.
Limit of resolution: de limiet van scheiding waarop twee objecten apart te zien zijn.
- De limit of resolution is afhankelijk van de golflengte van het licht en de numerical aperture
van het lenssysteem.
o De numerical aperture beschrijft het vermogen van de lens om licht op te vangen en
is afhankelijk van de hoek waarop de microscoop het licht opvangt en de refractive
index medium van de lens.
o De refractive index van het medium is de ratio van de snelheid van licht in vacuüm
tegenover de snelheid in het medium.
Er is een verschil tussen resolutie en detectie. Ook als een element veel kleiner is dan de resolutie kan
je het nogsteeds detecteerbaar maken door bijvoorbeeld fluorescerende labeling.
Elke afbeelding (optisch of electrisch) wordt gemaakt door deeltjes zoals fotonen. Echter door
kwantummechanica is er altijd een niet te voorspellen locatie. Daarnaast is er ook altijd een
achtergrond ruis. Als er minder onderdelen zijn in sample is er altijd en groter effect van de
willekeurigheid van de partikels, en krijg je dus een minder nauwkeurig beeld.
Bright field microscope: licht dat door een celculture valt vormt het beeld.
Dark field microscope: alleen het weerkaatste licht wordt opgevangen waardoor je een wit beeld op
een zwarte achtergrond krijgt.
Phase contrast microscope: afhankelijk van de dichtheid van bepaalde celonderdelen beweegt licht
sneller of langzamer (refractive index). Dit wordt verstekt door deze microscoop zodat je een meer
overdreven beeld krijgt van de celstructuren (wordt ook toegepast bij differential-interference-
contrast microscope).
Bij alle drie deze technieken is het mogelijk om naar bewegingen en cel processen te kijken.
Door electronic imaging systems worden twee imperfecties van het menselijke oog omzeild: we
kunnen namelijk niet goed zien in condities van weinig licht, en we zien weinig verschil in condities
met enorm veel achtergrond licht. Afbeelding sensoren (CCD of CMOS) kunnen worden toegevoegd
aan licht microscopen en zijn tot wel 10x meer gevoelig dan menselijke ogen. Hierdoor kunnen we
over lange tijd kijken naar condities met weinig licht. Ook kan door afbeelding bewerking problemen
in contrast en achtergrond waas verholpen worden.
