Hoofdstuk 3: Klassieke & alternatieve detectiemethoden
3.1 ISO-methoden & klassieke cultuurmethoden
Gestandaardiseerde methoden (ISO) erkend als referentie officiële controles
Gebaseerd op klassieke cultuurmethoden meestal steunt op gebruik selectieve
differentiërende media voor groeien, isoleren & tellen doelwitorganisme
3.1.1 Klassieke cultuurmethode (kweekmethode)
Detectie berust op vermogen van m.o om zich onder geschikte omstandigheden te
vermenigvuldigen tot aantallen waarbij waarneming mogelijk is.
4 opeenvolgende stappen:
1) Vooraanrijking op niet-selectief/half-selectief medium herstel van “gestresseerde”
m.o teweegbrengen
2) Aanrijking in selectief medium competitieve flora wordt geïnhibeerd & er is groei
3) Isolatie (detectie) op selectief differentiërend medium
4) Opzuivering verdachte kolonie & bevestigende testen uitvoeren
Duurt 1 tot 4 dagen
Voordeel: - goedkope methode
Nadeel: - vraagt veel tijd
- grote volumes media
3.2 Alternatieve (snelle) methoden
Vervangt stap 3 & 4 klassieke methode
Snel refereren naar kortere tijd tot detectie & automatisatie
Kan industrie helpen voor nieuwe manieren met betrouwbare resultaten en
voedselveiligheid te garanderen
,3.2.1 Chromogene voedingsbodems
Aantonen van enzymatische activiteit =
veelgebruikt identificatiemiddel
bacterie op agarplaat met substraat reactie
zichtbaar doordat kolonies en/of
voedingsbodems verkleuren
chromogene voedingsbodems zitten
chromogene of fluorogene substraten
organisme zal chromogeen of fluorogeen
afsplitsen (=kleurverandering of bij fluorogeen,
fluorescentie)
Voordeel: - sneller determineren
- goedkoper
Werking chromogeen substraat
3.2.2 Immunologische methoden
Gebaseerd op specifieke binding tussen
antilichamen en antigenen
Antilichamen= eiwitten die door de mens gesynthetiseerd worden als reactie op het antigen
Antigenen= lichaamsvreemde stoffen
Verschil klassieke methode = stap 3 : hier wordt gebruik gemaakt van specificiteit
antigen-antilichaam verloopt sneller
2 verschillende immunoassays: ELISAs & Agglutinatie test
3.2.2.1 Enzyme Linked Immunosorbent Assays (ELISAs)
Meestal sandwich ELISA = specifieke antilichamen gecoat op cupje staal, met
hoeveelheid antigen van m.o, toegevoegd en bindt met elkaar antilichaam (enzym-
gelabeld) wordt specifiek tegen antigen toegevoegd vervolgens substraat toevoegen
(wordt omgezet door enzym) verkregen signaal is maat voor de hoeveelheid
antigen aanwezig is
Voordelen: - minder arbeidsintensief
- verbeterde reproduceerbaarheid & standaardisatie
VIDAS (=geautomatiseerd systeem) 45-120 min
3.2.2.2 Agglutinatie test
, Gebaseerd op specifieke interactie tussen antilichamen en antigenen
Maar op stap 4 (bevestigende test) : m.o zal rol van antigen hebben
Aanwezig? = antilichaam dat is toegevoegd op inert partikel reageren met antigen
ontstaan samenklontering (agglutinatie) door cross-linking
A. Serotypering
Eventueel vervolg stap 4
Bepalen antigenische kenmerken kiem
aanwezigheid: O-antigen op celwand / H-antigen op flagellen
3.2.3 Moleculaire methoden
gebaseerd op genetisch materiaal (DNA/RNA)
2 enkelstrengige DNA moleculen hybridiseren door baseparen
PCR (plymerase chain reaction of polemyrase kettingreactie)
mogelijkheid grote hoeveelheid aan te maken van klein stukje DNA
DNA polymerase word gebruikt want is in staat om DNA streng te kopiëren
Target dat gekopieerd word is gespecifieerd
door keuze primers (= korte oligonuleotiden waarvan
sequentie complementair is met einde targetregio)
PCR omvat 3 stappen: 1) DNA wordt gedenatureerd.
Strengen scheiden door verhitting tot
95°C
2) temperatuur verlaagd 65°C
toevoeging primers (één die
past aan begin en één aan
einde)
3) temperatuur verhoogt 72°C toevoeging enzym polymerase en
groot aantal nucleotiden hierdoor complementaire streng
geproduceerd en nieuw dbss DNA
Real-time PCR (qPCR) variant waarbij ook online kwantificatie gebeurt
PCR 30-90 min in beslag stap 1 & 2 nog steeds nodig
3.1 ISO-methoden & klassieke cultuurmethoden
Gestandaardiseerde methoden (ISO) erkend als referentie officiële controles
Gebaseerd op klassieke cultuurmethoden meestal steunt op gebruik selectieve
differentiërende media voor groeien, isoleren & tellen doelwitorganisme
3.1.1 Klassieke cultuurmethode (kweekmethode)
Detectie berust op vermogen van m.o om zich onder geschikte omstandigheden te
vermenigvuldigen tot aantallen waarbij waarneming mogelijk is.
4 opeenvolgende stappen:
1) Vooraanrijking op niet-selectief/half-selectief medium herstel van “gestresseerde”
m.o teweegbrengen
2) Aanrijking in selectief medium competitieve flora wordt geïnhibeerd & er is groei
3) Isolatie (detectie) op selectief differentiërend medium
4) Opzuivering verdachte kolonie & bevestigende testen uitvoeren
Duurt 1 tot 4 dagen
Voordeel: - goedkope methode
Nadeel: - vraagt veel tijd
- grote volumes media
3.2 Alternatieve (snelle) methoden
Vervangt stap 3 & 4 klassieke methode
Snel refereren naar kortere tijd tot detectie & automatisatie
Kan industrie helpen voor nieuwe manieren met betrouwbare resultaten en
voedselveiligheid te garanderen
,3.2.1 Chromogene voedingsbodems
Aantonen van enzymatische activiteit =
veelgebruikt identificatiemiddel
bacterie op agarplaat met substraat reactie
zichtbaar doordat kolonies en/of
voedingsbodems verkleuren
chromogene voedingsbodems zitten
chromogene of fluorogene substraten
organisme zal chromogeen of fluorogeen
afsplitsen (=kleurverandering of bij fluorogeen,
fluorescentie)
Voordeel: - sneller determineren
- goedkoper
Werking chromogeen substraat
3.2.2 Immunologische methoden
Gebaseerd op specifieke binding tussen
antilichamen en antigenen
Antilichamen= eiwitten die door de mens gesynthetiseerd worden als reactie op het antigen
Antigenen= lichaamsvreemde stoffen
Verschil klassieke methode = stap 3 : hier wordt gebruik gemaakt van specificiteit
antigen-antilichaam verloopt sneller
2 verschillende immunoassays: ELISAs & Agglutinatie test
3.2.2.1 Enzyme Linked Immunosorbent Assays (ELISAs)
Meestal sandwich ELISA = specifieke antilichamen gecoat op cupje staal, met
hoeveelheid antigen van m.o, toegevoegd en bindt met elkaar antilichaam (enzym-
gelabeld) wordt specifiek tegen antigen toegevoegd vervolgens substraat toevoegen
(wordt omgezet door enzym) verkregen signaal is maat voor de hoeveelheid
antigen aanwezig is
Voordelen: - minder arbeidsintensief
- verbeterde reproduceerbaarheid & standaardisatie
VIDAS (=geautomatiseerd systeem) 45-120 min
3.2.2.2 Agglutinatie test
, Gebaseerd op specifieke interactie tussen antilichamen en antigenen
Maar op stap 4 (bevestigende test) : m.o zal rol van antigen hebben
Aanwezig? = antilichaam dat is toegevoegd op inert partikel reageren met antigen
ontstaan samenklontering (agglutinatie) door cross-linking
A. Serotypering
Eventueel vervolg stap 4
Bepalen antigenische kenmerken kiem
aanwezigheid: O-antigen op celwand / H-antigen op flagellen
3.2.3 Moleculaire methoden
gebaseerd op genetisch materiaal (DNA/RNA)
2 enkelstrengige DNA moleculen hybridiseren door baseparen
PCR (plymerase chain reaction of polemyrase kettingreactie)
mogelijkheid grote hoeveelheid aan te maken van klein stukje DNA
DNA polymerase word gebruikt want is in staat om DNA streng te kopiëren
Target dat gekopieerd word is gespecifieerd
door keuze primers (= korte oligonuleotiden waarvan
sequentie complementair is met einde targetregio)
PCR omvat 3 stappen: 1) DNA wordt gedenatureerd.
Strengen scheiden door verhitting tot
95°C
2) temperatuur verlaagd 65°C
toevoeging primers (één die
past aan begin en één aan
einde)
3) temperatuur verhoogt 72°C toevoeging enzym polymerase en
groot aantal nucleotiden hierdoor complementaire streng
geproduceerd en nieuw dbss DNA
Real-time PCR (qPCR) variant waarbij ook online kwantificatie gebeurt
PCR 30-90 min in beslag stap 1 & 2 nog steeds nodig
