1 Basisprincipes elektroforese
1.1 Inleiding
1.1.1 Definitie
Elektroforese= Beweging elektrisch geladen deeltje in een elektrisch veld. Als ≠ deeltjes in dit veld
met een ≠ snelheid migreren → gescheiden.
Zone-elektroforese= Monster wordt in een specifieke zone aangebracht, waardoor de zones na
elektroforese opsplitsen in verschillende zones:
Elektroforetische migratie
Diffusie: zones verbreed (migratiesnelheid is niet voor alle deeltjes gelijk)
Convenctie: zones vervormd (verhoging migratiesnelheid= meegaan migratierichting)
1.1.2 Elektroforetische migratie
Krachten die op deeltje inwerken:
1. Elektrische kracht → snelheid waarmee deeltje beweegt in elektrisch veld neemt toe
2. Wrijvingskracht → naarmate snelheid stijgt, stijgt aantal botsingen
Op bepaald moment: elektrische kracht = wrijvingskracht
1.1.2.1 Veldsterkte (E)
∆𝑈 ∆𝑈= spanning in V
E=
∆𝑥 ∆𝑥= afstand in m
Meestal ligt afstand vast, zodat veldsterkte enkel gewijzigd kan worden door de spanning te wijzigen.
1.1.2.2 Elektrische kracht (Fq) E= veldsterkte
Fq = E . Q Q= lading deeltje
De kracht die uitgeoefend wordt op een geladen deeltje in elektrisch veld.
1.1.2.3 Wrijvingskracht (Ff) f= wrijvingscoëfficiënt
Ff = f . v v= snelheid deeltje
f is afhankelijk van grootte/vorm deeltje en de viscositeit van de oplossing.
1.1.2.4 Migratiesnelheid (v)
𝐸.𝑄
v= 𝑓
(Fq = Ff → deeltje beweegt met een constante snelheid)
1.1.2.5 Mobiliteit (m)
𝑣 𝑄
𝑚= =
𝐸 𝑓
1.1.2.6 Migratie van bolvormige deeltjes
𝑓 = 6. 𝜋. 𝑅. 𝑛
𝐸. 𝑄
𝑣=
6. 𝜋. 𝑅. 𝑛
𝑄
𝑚=
6. 𝜋. 𝑅. 𝑛
AD Biochemische technieken - Deel 2: Elektroforese 1
,1.1.2.7 Invloeden van mobiliteit
Mobiliteit van biomoleculen is in functie van:
- pH: beïnvloedt ladingverandering en conformatieverandering
- Temperatuur: beïnvloedt de viscositeitsverandering en lading
- Invloed van watermantel en ionensterkte
o Straal altijd groter dan in werkelijkheid, omdat watermantel rond het deeltje zit
→ mobiliteit lager
o Q altijd lager (afscherming deeltje) → mobiliteit lager
Actuele mobiliteit mobiliteit van het deeltje in de oplossing
Absolute mobiliteit mobiliteit van het deeltje wanneer de andere componenten 0 zijn
mobiliteit van de component als geheel, waarbij deze component
Effectieve mobiliteit
verschillende vormen kan hebben. 𝑚𝑒𝑓𝑓 = ∑ 𝑥𝑖 . 𝑚𝑖
Voorbeeld: azijnzuur CH3COOH CH3COO- + H+ → pKa= 4,76
[𝐶𝐻3𝐶𝑂𝑂𝐻] (𝑧𝑢𝑢𝑟)
pH = pKa – log [𝐶𝐻3𝐶𝑂𝑂−] (𝑏𝑎𝑠𝑒)
[𝑪𝑯𝟑𝑪𝑶𝑶𝑯]
4,76 = 4,76 – log [𝑪𝑯𝟑𝑪𝑶𝑶−] moet 1 zijn → 50% CH3COOH → geen mobiliteit, geen lading
→ 50% CH3COO- → effectieve mobiliteit (ioniserende vorm)
1.1.3 Diffusie
= bepaalde richting, gevolg van concentratieverschillen in een oplossing.
Diffusiecoëfficiënt= eigen aan een molecule. D= (k.T)/6𝜋R
Als T stijgt → stijgt diffusie
Als R stijgt → daalt diffusie (grotere deeltjes diffunderen trager)
Voorzorgen tegen diffusie:
- Lage temperatuur
- Elektroforese zo kort mogelijk
- Na lading, staal zo snel mogelijk laten lopen
- Kleine moleculen zijn problematisch
1.1.4 Convectie
= een bepaalde richting, gevolg van drukverschillen in een oplossing.
1.1.4.1 Elektro-endosmose
pH groter dan 3 → glas geeft kationen (+) af. Kationen omringt met
watermoleculen migreren naar kathode (-) → vloeistof stroomt.
Anionen (-) in glaswand worden aangetrokken tot de anode (+),
maar dit gaat niet, want zitten vast in glaswand → geen migratie.
Te scheiden anionen vanuit de oplossing (midden tekening) gaan wel
migreren naar anode.
Probleem: anionen worden tegengewerkt door de vloeistofstroming
𝜀 ..𝐸 → hoe meer ionen afgestaan door glaswand, hoe hoger zetapotentiaal en elektro-
𝑣=
endosmosesnelheid
Zetapotentiaal= potentiaalverschil tussen de negatieve anionen in de glaswand en de positieve
kationen in de oplossing. Daalt bij een stijging van de ionensterkte in de oplossing.
AD Biochemische technieken - Deel 2: Elektroforese 2
, Praktisch:
Agarose gel: hierop zitten sulfaatgroepen met een negatieve lading met een tegenion natrium →
Natrium ionen kunnen eraf → migreren naar kathode → vloeistofstroming naar kathode.
DNA (negatief geladen) migreren naar anode, maar door natriumionen (vloeistofstroming naar
kathode) wordt DNA tegengehouden.
1.1.4.2 Capillaire krachten
Zorgen ervoor dat de bufferoplossing op alle plaatsen hetzelfde blijft. Door verdamping kan deze
verschillen en moet deze aangepast worden.
1.1.4.3 Drukverschillen
Ontstaan door verschillen in dichtheid in het gel.
Gevolg van:
- Verschillen in T en samenstelling oplossing
- Hoogteverschil tss niveau van buffervaten bij horizontale elektroforese
- Temperatuurverschillen in gel
- Drukverschillen in medium
1.1.4.4 Temperatuurverschillen
Leiden tot verschillen in dichtheid en verdamping → vloeistofstroming
Wat doen om convectie te vermijden:
- Goede koeling van matrix
- Homogene gel
- Opgelet bij horizontale gels → gelijke vloeistofniveaus in buffervaten
- Matrix met zo laag mogelijk elektro-endosmose getal
1.1.5 Warmte ontwikkeling
Probleem als T stijgt want dan stijgt mobiliteit, diffusie en convectie → beperken van de warmte
ontwikkeling.
Hoe:
1. Potentiaal verschil verlagen zodat de migratiesnelheid verlaagt. (daling veldsterkte)
Potentiaal verschil verlagen → verhoogde diffusie
2. I (stroomsterkte) daling indien een laag geleidend vermogen (enkel mogelijk bij grote
buffercomponenten)
3. Koeling: submariene: verdamping beperken.
Bij PAGE eventueel koelen via buffer
Blotting: koelelementen toevoegen aan elektroforesekamer
Iso-elektrisch foccusering (IEF): koelplaat met dunne gel op plastiek folie
1.2 Experimentele aspecten
1.2.1 Matrix
1.2.1.1 Soorten
- Cellulose-acetaat
- Agar
- Agarose en polyacrylamide → meest gebruikt voor EW en NZ elektroforse
AD Biochemische technieken - Deel 2: Elektroforese 3
1.1 Inleiding
1.1.1 Definitie
Elektroforese= Beweging elektrisch geladen deeltje in een elektrisch veld. Als ≠ deeltjes in dit veld
met een ≠ snelheid migreren → gescheiden.
Zone-elektroforese= Monster wordt in een specifieke zone aangebracht, waardoor de zones na
elektroforese opsplitsen in verschillende zones:
Elektroforetische migratie
Diffusie: zones verbreed (migratiesnelheid is niet voor alle deeltjes gelijk)
Convenctie: zones vervormd (verhoging migratiesnelheid= meegaan migratierichting)
1.1.2 Elektroforetische migratie
Krachten die op deeltje inwerken:
1. Elektrische kracht → snelheid waarmee deeltje beweegt in elektrisch veld neemt toe
2. Wrijvingskracht → naarmate snelheid stijgt, stijgt aantal botsingen
Op bepaald moment: elektrische kracht = wrijvingskracht
1.1.2.1 Veldsterkte (E)
∆𝑈 ∆𝑈= spanning in V
E=
∆𝑥 ∆𝑥= afstand in m
Meestal ligt afstand vast, zodat veldsterkte enkel gewijzigd kan worden door de spanning te wijzigen.
1.1.2.2 Elektrische kracht (Fq) E= veldsterkte
Fq = E . Q Q= lading deeltje
De kracht die uitgeoefend wordt op een geladen deeltje in elektrisch veld.
1.1.2.3 Wrijvingskracht (Ff) f= wrijvingscoëfficiënt
Ff = f . v v= snelheid deeltje
f is afhankelijk van grootte/vorm deeltje en de viscositeit van de oplossing.
1.1.2.4 Migratiesnelheid (v)
𝐸.𝑄
v= 𝑓
(Fq = Ff → deeltje beweegt met een constante snelheid)
1.1.2.5 Mobiliteit (m)
𝑣 𝑄
𝑚= =
𝐸 𝑓
1.1.2.6 Migratie van bolvormige deeltjes
𝑓 = 6. 𝜋. 𝑅. 𝑛
𝐸. 𝑄
𝑣=
6. 𝜋. 𝑅. 𝑛
𝑄
𝑚=
6. 𝜋. 𝑅. 𝑛
AD Biochemische technieken - Deel 2: Elektroforese 1
,1.1.2.7 Invloeden van mobiliteit
Mobiliteit van biomoleculen is in functie van:
- pH: beïnvloedt ladingverandering en conformatieverandering
- Temperatuur: beïnvloedt de viscositeitsverandering en lading
- Invloed van watermantel en ionensterkte
o Straal altijd groter dan in werkelijkheid, omdat watermantel rond het deeltje zit
→ mobiliteit lager
o Q altijd lager (afscherming deeltje) → mobiliteit lager
Actuele mobiliteit mobiliteit van het deeltje in de oplossing
Absolute mobiliteit mobiliteit van het deeltje wanneer de andere componenten 0 zijn
mobiliteit van de component als geheel, waarbij deze component
Effectieve mobiliteit
verschillende vormen kan hebben. 𝑚𝑒𝑓𝑓 = ∑ 𝑥𝑖 . 𝑚𝑖
Voorbeeld: azijnzuur CH3COOH CH3COO- + H+ → pKa= 4,76
[𝐶𝐻3𝐶𝑂𝑂𝐻] (𝑧𝑢𝑢𝑟)
pH = pKa – log [𝐶𝐻3𝐶𝑂𝑂−] (𝑏𝑎𝑠𝑒)
[𝑪𝑯𝟑𝑪𝑶𝑶𝑯]
4,76 = 4,76 – log [𝑪𝑯𝟑𝑪𝑶𝑶−] moet 1 zijn → 50% CH3COOH → geen mobiliteit, geen lading
→ 50% CH3COO- → effectieve mobiliteit (ioniserende vorm)
1.1.3 Diffusie
= bepaalde richting, gevolg van concentratieverschillen in een oplossing.
Diffusiecoëfficiënt= eigen aan een molecule. D= (k.T)/6𝜋R
Als T stijgt → stijgt diffusie
Als R stijgt → daalt diffusie (grotere deeltjes diffunderen trager)
Voorzorgen tegen diffusie:
- Lage temperatuur
- Elektroforese zo kort mogelijk
- Na lading, staal zo snel mogelijk laten lopen
- Kleine moleculen zijn problematisch
1.1.4 Convectie
= een bepaalde richting, gevolg van drukverschillen in een oplossing.
1.1.4.1 Elektro-endosmose
pH groter dan 3 → glas geeft kationen (+) af. Kationen omringt met
watermoleculen migreren naar kathode (-) → vloeistof stroomt.
Anionen (-) in glaswand worden aangetrokken tot de anode (+),
maar dit gaat niet, want zitten vast in glaswand → geen migratie.
Te scheiden anionen vanuit de oplossing (midden tekening) gaan wel
migreren naar anode.
Probleem: anionen worden tegengewerkt door de vloeistofstroming
𝜀 ..𝐸 → hoe meer ionen afgestaan door glaswand, hoe hoger zetapotentiaal en elektro-
𝑣=
endosmosesnelheid
Zetapotentiaal= potentiaalverschil tussen de negatieve anionen in de glaswand en de positieve
kationen in de oplossing. Daalt bij een stijging van de ionensterkte in de oplossing.
AD Biochemische technieken - Deel 2: Elektroforese 2
, Praktisch:
Agarose gel: hierop zitten sulfaatgroepen met een negatieve lading met een tegenion natrium →
Natrium ionen kunnen eraf → migreren naar kathode → vloeistofstroming naar kathode.
DNA (negatief geladen) migreren naar anode, maar door natriumionen (vloeistofstroming naar
kathode) wordt DNA tegengehouden.
1.1.4.2 Capillaire krachten
Zorgen ervoor dat de bufferoplossing op alle plaatsen hetzelfde blijft. Door verdamping kan deze
verschillen en moet deze aangepast worden.
1.1.4.3 Drukverschillen
Ontstaan door verschillen in dichtheid in het gel.
Gevolg van:
- Verschillen in T en samenstelling oplossing
- Hoogteverschil tss niveau van buffervaten bij horizontale elektroforese
- Temperatuurverschillen in gel
- Drukverschillen in medium
1.1.4.4 Temperatuurverschillen
Leiden tot verschillen in dichtheid en verdamping → vloeistofstroming
Wat doen om convectie te vermijden:
- Goede koeling van matrix
- Homogene gel
- Opgelet bij horizontale gels → gelijke vloeistofniveaus in buffervaten
- Matrix met zo laag mogelijk elektro-endosmose getal
1.1.5 Warmte ontwikkeling
Probleem als T stijgt want dan stijgt mobiliteit, diffusie en convectie → beperken van de warmte
ontwikkeling.
Hoe:
1. Potentiaal verschil verlagen zodat de migratiesnelheid verlaagt. (daling veldsterkte)
Potentiaal verschil verlagen → verhoogde diffusie
2. I (stroomsterkte) daling indien een laag geleidend vermogen (enkel mogelijk bij grote
buffercomponenten)
3. Koeling: submariene: verdamping beperken.
Bij PAGE eventueel koelen via buffer
Blotting: koelelementen toevoegen aan elektroforesekamer
Iso-elektrisch foccusering (IEF): koelplaat met dunne gel op plastiek folie
1.2 Experimentele aspecten
1.2.1 Matrix
1.2.1.1 Soorten
- Cellulose-acetaat
- Agar
- Agarose en polyacrylamide → meest gebruikt voor EW en NZ elektroforse
AD Biochemische technieken - Deel 2: Elektroforese 3
