3 kleurstoffen: Cy3, Cy5 en Cy7
Welk molecule hoort bij welk spectrum en waarom?
• Cy7 heeft het langste geconjugeerd systeem en Cy3 het kortste.
• Het verlengen van een geconjugeerd systeem heeft een Auxochromatisch effect. Dit houdt in dat het
verlengen invloed heeft op hoe het molecuul licht absorbeert, het verschuift de absorptie naar langere
golflengten (vaak richting rood of infrarood).
• In een geconjugeerd system zijn π-bindingen gedelokaliseerd over meerdere dubbele bindingen. Hoe langer
dit system is hoe Kleiner het energieverschil tussen HOMO en LUMO. Het energieverschil tussen deze
orbitaaltypen bepaalt de absorptiegolflengte.
ℎ𝑐
• Een Kleiner energieverschil betekent dat licht bij lageren energie wordt geabsorbeerd: 𝐸 = ℎ𝑣 = 𝜆
→ lagere
E = hogere λ.
• Meer dubbele bindingen → grotere delokalisatie an elektronen (& hogere stabiliteit van het aangeslagen
niveau) → lagere E nodig voor excitatie → absorberen bij hogere golflengte.
• DUS: Cy3 is groen, Cy5 is rood, Cy7 is Bordeaux
Als je bij 500nm exciteert, hoe ziet het fluorescentiespsectrum van een 10-6M mengelijk eruit?
• Bij excitatie op 500 nm wordt voornamelijk Cy3 geëxciteerd,
omdat dit molecuul een absorptiemaximum heeft rond deze
golflengte. Het fluorescentiespectrum van het mengsel bij
excitatie op 500 nm toont een duidelijke piek rond 570–580 nm,
afkomstig van Cy3.
• Cy5 en Cy7 hebben langere geconjugeerde systemen en
absorberen bij hogere golflengten (respectievelijk rond 650 nm
en 750 nm), waardoor zij bij 500 nm niet effectief worden
geëxciteerd.
, Hoe veranderd het fluorescentiespectrum als je bij een hogere concentratie van 10-4M werkt?
• Zelfabsorptie (reabsorptie): De uitgestraalde fluorescentie van Cy3 (rond 570–580 nm) kan gedeeltelijk
opnieuw geabsorbeerd worden door andere Cy3-moleculen. Dit leidt tot een vervorming van het
emissiespectrum, vaak met een verminderde intensiteit en een verschuiving naar langere golflengten.
• Quenching (demping van fluorescentie): Bij hogere concentraties kunnen moleculen dichter bij elkaar
komen, waardoor interacties zoals statische of dynamische quenching optreden. Dit resulteert in een lagere
fluorescentie-intensiteit, ondanks de hogere hoeveelheid fluoroforen.
• Energieoverdracht (FRET): Als Cy3 wordt geëxciteerd en Cy5 zich in de buurt bevindt, kan fluorescentie-
resonantie-energieoverdracht (FRET) optreden. Cy3 fungeert dan als donor en Cy5 als acceptor, waardoor
emissie van Cy5 rond 670 nm kan optreden, zelfs al wordt Cy5 niet direct geëxciteerd bij 500 nm. Dit kan
leiden tot extra pieken in het spectrum bij de emissiegolflengte van Cy5.
Er is een Raman-band bij 3050 cm⁻¹. Geeft dit interferentie met het fluorescentiespectrum?
Een Raman-band bij 3050 cm⁻¹ betekent dat het uitgestraalde licht 3050 cm⁻¹ lager in energie is dan het
excitatielicht.
We berekenen de golflengte van het Raman-signaal:
1
• Frequentie van 500 nm licht:𝑣̃ 𝑙𝑎𝑠𝑒𝑟 = = 20000 𝑐𝑚−1
500 .10−7 𝑐𝑚
• Raman-emissie: 𝑣̃ 𝑟𝑎𝑚𝑎𝑛 = 20000 𝑐𝑚 −1
− 3050 𝑐𝑚−1 = 16950 𝑐𝑚−1
1
• Omrekenen naar golflengte: 𝜆𝑟𝑎𝑚𝑎𝑛 = 𝑐𝑚 = 590𝑛𝑚
16950
Bij excitatie op 500 nm resulteert een Raman-verschuiving van 3050 cm⁻¹ in een emissie rond 590 nm. Deze
golflengte ligt dicht bij de fluorescentie-emissie van Cy3, die zich bevindt rond 570–580 nm. Door deze spectrale
overlap ontstaat interferentie, waardoor het Raman-signaal gemakkelijk wordt overstemd door de sterkere en
bredere fluorescentie. Het onderscheiden van Raman-signalen onder deze omstandigheden is daarom lastig zonder
het gebruik van spectrale filters of tijdsresolutie.
De quantumyied van Cy3 is 0,9. Hoe zal deze evolueren naarmate het molecule groter wordt?
De quantum yield (QY) geeft aan hoe efficiënt een molecuul fluoresceert, oftewel welk deel van de geabsorbeerde
lichtenergie wordt uitgezonden als fluorescentie.
Een hoge QY, zoals bij Cy3 (~0,9), betekent dat het molecuul zeer efficiënt licht uitzendt na excitatie. Naarmate het
molecuul groter wordt, zoals bij Cy5 en Cy7, daalt de quantum yield merkbaar. Dit komt doordat grotere moleculen
meer interne vrijheidsgraden hebben, zoals extra rotatie- en vibratiemodi, waardoor er meer mogelijkheden ontstaan
om energie kwijt te raken via niet-radiatieve relaxatieprocessen. In plaats van licht uit te zenden, verliest het
molecuul dan energie als warmte of beweging.
Bovendien zijn grotere moleculen gevoeliger voor quenching: interacties met de omgeving (zoals zuurstof of
solventmoleculen) kunnen de fluorescentie onderdrukken. Door deze factoren neemt de efficiëntie van
fluorescentie af bij grotere moleculen, en daalt de quantum yield. Cy3 fluoresceert dus veel sterker dan Cy5 of Cy7,
die door hun grotere structuur meer energie verliezen zonder licht uit te zenden.
, Electronic transitions
Membraan fusie wordt onderzocht door een mengsel te maken van vesikels met een kleurstof (pyreen) en gewone
membraan partikels.
Hoe zal het absorptiespectrum en emissiespectrum evolueren? Maak tekeningen, benoem en beschrijf ze.
Absorptiespectrum: Pyreen absorbeert UV-licht met een karakteristieke piek rond 340 nm. Deze absorptie is
onafhankelijk van de aggregatietoestand van de pyreenmoleculen (monomeer of excimer), aangezien excimers
uitsluitend gevormd worden in de geëxciteerde toestand. Tijdens membraanfusie blijft het absorptiespectrum
nagenoeg onveranderd, omwille van de volgende redenen:
• De totale hoeveelheid pyreen in het systeem blijft constant.
• De absorptie is niet gevoelig voor verdunning of veranderingen in intermoleculaire afstand.
Emissiespectrum: Pyreen vertoont twee soorten fluorescentie afhankelijk van de lokale concentratie en afstand
tussen pyreenmoleculen:
• Monomeerfluorescentie
o Emissie bij 370–390 nm.
o Ontstaat wanneer een pyreenmolecuul geïsoleerd geëxciteerd wordt en terugvalt naar de
grondtoestand.
• Excimerfluorescentie:
o Brede emissie bij 470–480 nm.
o Ontstaat wanneer een geëxciteerd pyreenmolecuul een tijdelijk complex vormt met een nabijgelegen
pyreen in de grondtoestand.
o Vereist hoge lokale concentratie van pyreen.
Evolutie tijdens membraanfusie:
• Voor fusie: Pyreenmoleculen zijn geconcentreerd in gelabelde vesikels, waardoor de kans op
excimervorming groot is. Deze excimers zenden fluorescentie uit bij een
langere golflengte (~470 nm), wat overeenkomt met een lagere energie-
uitzending dan monomeren. Het emissiespectrum wordt dan
gedomineerd door redshifted excimerfluorescentie.
• Na fusie: Tijdens fusie met ongelabelde membraanpartikels worden de
pyreenmoleculen verdund over een groter membraanoppervlak.
Hierdoor daalt de kans op excimervorming, en nemen
monomeerinteracties toe. Dit leidt tot een afname van excimer-emissie
en een toename van monomeerfluorescentie bij kortere golflengte
(~390 nm), wat duidt op een hogere energie-uitzending.
Deze spectrale verschuiving van redshifted excimerfluorescentie naar blueshifted monomeerfluorescentie
vormt een gevoelige en directe maat voor lipidenmenging en membraanfusie.
Welk molecule hoort bij welk spectrum en waarom?
• Cy7 heeft het langste geconjugeerd systeem en Cy3 het kortste.
• Het verlengen van een geconjugeerd systeem heeft een Auxochromatisch effect. Dit houdt in dat het
verlengen invloed heeft op hoe het molecuul licht absorbeert, het verschuift de absorptie naar langere
golflengten (vaak richting rood of infrarood).
• In een geconjugeerd system zijn π-bindingen gedelokaliseerd over meerdere dubbele bindingen. Hoe langer
dit system is hoe Kleiner het energieverschil tussen HOMO en LUMO. Het energieverschil tussen deze
orbitaaltypen bepaalt de absorptiegolflengte.
ℎ𝑐
• Een Kleiner energieverschil betekent dat licht bij lageren energie wordt geabsorbeerd: 𝐸 = ℎ𝑣 = 𝜆
→ lagere
E = hogere λ.
• Meer dubbele bindingen → grotere delokalisatie an elektronen (& hogere stabiliteit van het aangeslagen
niveau) → lagere E nodig voor excitatie → absorberen bij hogere golflengte.
• DUS: Cy3 is groen, Cy5 is rood, Cy7 is Bordeaux
Als je bij 500nm exciteert, hoe ziet het fluorescentiespsectrum van een 10-6M mengelijk eruit?
• Bij excitatie op 500 nm wordt voornamelijk Cy3 geëxciteerd,
omdat dit molecuul een absorptiemaximum heeft rond deze
golflengte. Het fluorescentiespectrum van het mengsel bij
excitatie op 500 nm toont een duidelijke piek rond 570–580 nm,
afkomstig van Cy3.
• Cy5 en Cy7 hebben langere geconjugeerde systemen en
absorberen bij hogere golflengten (respectievelijk rond 650 nm
en 750 nm), waardoor zij bij 500 nm niet effectief worden
geëxciteerd.
, Hoe veranderd het fluorescentiespectrum als je bij een hogere concentratie van 10-4M werkt?
• Zelfabsorptie (reabsorptie): De uitgestraalde fluorescentie van Cy3 (rond 570–580 nm) kan gedeeltelijk
opnieuw geabsorbeerd worden door andere Cy3-moleculen. Dit leidt tot een vervorming van het
emissiespectrum, vaak met een verminderde intensiteit en een verschuiving naar langere golflengten.
• Quenching (demping van fluorescentie): Bij hogere concentraties kunnen moleculen dichter bij elkaar
komen, waardoor interacties zoals statische of dynamische quenching optreden. Dit resulteert in een lagere
fluorescentie-intensiteit, ondanks de hogere hoeveelheid fluoroforen.
• Energieoverdracht (FRET): Als Cy3 wordt geëxciteerd en Cy5 zich in de buurt bevindt, kan fluorescentie-
resonantie-energieoverdracht (FRET) optreden. Cy3 fungeert dan als donor en Cy5 als acceptor, waardoor
emissie van Cy5 rond 670 nm kan optreden, zelfs al wordt Cy5 niet direct geëxciteerd bij 500 nm. Dit kan
leiden tot extra pieken in het spectrum bij de emissiegolflengte van Cy5.
Er is een Raman-band bij 3050 cm⁻¹. Geeft dit interferentie met het fluorescentiespectrum?
Een Raman-band bij 3050 cm⁻¹ betekent dat het uitgestraalde licht 3050 cm⁻¹ lager in energie is dan het
excitatielicht.
We berekenen de golflengte van het Raman-signaal:
1
• Frequentie van 500 nm licht:𝑣̃ 𝑙𝑎𝑠𝑒𝑟 = = 20000 𝑐𝑚−1
500 .10−7 𝑐𝑚
• Raman-emissie: 𝑣̃ 𝑟𝑎𝑚𝑎𝑛 = 20000 𝑐𝑚 −1
− 3050 𝑐𝑚−1 = 16950 𝑐𝑚−1
1
• Omrekenen naar golflengte: 𝜆𝑟𝑎𝑚𝑎𝑛 = 𝑐𝑚 = 590𝑛𝑚
16950
Bij excitatie op 500 nm resulteert een Raman-verschuiving van 3050 cm⁻¹ in een emissie rond 590 nm. Deze
golflengte ligt dicht bij de fluorescentie-emissie van Cy3, die zich bevindt rond 570–580 nm. Door deze spectrale
overlap ontstaat interferentie, waardoor het Raman-signaal gemakkelijk wordt overstemd door de sterkere en
bredere fluorescentie. Het onderscheiden van Raman-signalen onder deze omstandigheden is daarom lastig zonder
het gebruik van spectrale filters of tijdsresolutie.
De quantumyied van Cy3 is 0,9. Hoe zal deze evolueren naarmate het molecule groter wordt?
De quantum yield (QY) geeft aan hoe efficiënt een molecuul fluoresceert, oftewel welk deel van de geabsorbeerde
lichtenergie wordt uitgezonden als fluorescentie.
Een hoge QY, zoals bij Cy3 (~0,9), betekent dat het molecuul zeer efficiënt licht uitzendt na excitatie. Naarmate het
molecuul groter wordt, zoals bij Cy5 en Cy7, daalt de quantum yield merkbaar. Dit komt doordat grotere moleculen
meer interne vrijheidsgraden hebben, zoals extra rotatie- en vibratiemodi, waardoor er meer mogelijkheden ontstaan
om energie kwijt te raken via niet-radiatieve relaxatieprocessen. In plaats van licht uit te zenden, verliest het
molecuul dan energie als warmte of beweging.
Bovendien zijn grotere moleculen gevoeliger voor quenching: interacties met de omgeving (zoals zuurstof of
solventmoleculen) kunnen de fluorescentie onderdrukken. Door deze factoren neemt de efficiëntie van
fluorescentie af bij grotere moleculen, en daalt de quantum yield. Cy3 fluoresceert dus veel sterker dan Cy5 of Cy7,
die door hun grotere structuur meer energie verliezen zonder licht uit te zenden.
, Electronic transitions
Membraan fusie wordt onderzocht door een mengsel te maken van vesikels met een kleurstof (pyreen) en gewone
membraan partikels.
Hoe zal het absorptiespectrum en emissiespectrum evolueren? Maak tekeningen, benoem en beschrijf ze.
Absorptiespectrum: Pyreen absorbeert UV-licht met een karakteristieke piek rond 340 nm. Deze absorptie is
onafhankelijk van de aggregatietoestand van de pyreenmoleculen (monomeer of excimer), aangezien excimers
uitsluitend gevormd worden in de geëxciteerde toestand. Tijdens membraanfusie blijft het absorptiespectrum
nagenoeg onveranderd, omwille van de volgende redenen:
• De totale hoeveelheid pyreen in het systeem blijft constant.
• De absorptie is niet gevoelig voor verdunning of veranderingen in intermoleculaire afstand.
Emissiespectrum: Pyreen vertoont twee soorten fluorescentie afhankelijk van de lokale concentratie en afstand
tussen pyreenmoleculen:
• Monomeerfluorescentie
o Emissie bij 370–390 nm.
o Ontstaat wanneer een pyreenmolecuul geïsoleerd geëxciteerd wordt en terugvalt naar de
grondtoestand.
• Excimerfluorescentie:
o Brede emissie bij 470–480 nm.
o Ontstaat wanneer een geëxciteerd pyreenmolecuul een tijdelijk complex vormt met een nabijgelegen
pyreen in de grondtoestand.
o Vereist hoge lokale concentratie van pyreen.
Evolutie tijdens membraanfusie:
• Voor fusie: Pyreenmoleculen zijn geconcentreerd in gelabelde vesikels, waardoor de kans op
excimervorming groot is. Deze excimers zenden fluorescentie uit bij een
langere golflengte (~470 nm), wat overeenkomt met een lagere energie-
uitzending dan monomeren. Het emissiespectrum wordt dan
gedomineerd door redshifted excimerfluorescentie.
• Na fusie: Tijdens fusie met ongelabelde membraanpartikels worden de
pyreenmoleculen verdund over een groter membraanoppervlak.
Hierdoor daalt de kans op excimervorming, en nemen
monomeerinteracties toe. Dit leidt tot een afname van excimer-emissie
en een toename van monomeerfluorescentie bij kortere golflengte
(~390 nm), wat duidt op een hogere energie-uitzending.
Deze spectrale verschuiving van redshifted excimerfluorescentie naar blueshifted monomeerfluorescentie
vormt een gevoelige en directe maat voor lipidenmenging en membraanfusie.
