SAMENVATTING
BIOTECHNOLOGIE
Theorie
Zoë Swinnen
,Zoë Swinnen
INHOUD
H1: Recombinant technologie en vector systemen in E.coli ......................................................4
1.1. Basisprincipes van de recombinant DNA-technologie ...............................................4
1.2. Biologische gastheren in moleculaire biotechnologie ................................................5
1.3. ontwikkeling van een vector......................................................................................6
1.4. Enzymen betrokken bij de klonering ..........................................................................7
1.5. DNA-inbreng methoden voor gastheercellen .............................................................9
1.6. Kolonie screening en selectiemerker ...................................................................... 10
1.7. Courante kloneringsvectoren ................................................................................. 13
H2: Nucleinezuur scheidingstechnieken ................................................................................ 16
2.1. Algemene principes nucleïnzuur opzuiveringstechnieken ........................................ 16
2.2. Chromosomaal DNA isolatie uit prokaryoten (bacteriën) ......................................... 16
2.3. Alkalische-SDS lyse methode voor plasmiden uit E.coli ........................................... 22
2.4. Eukaryoot genomisch DNA-isolatie......................................................................... 23
2.5. Nucleïnezuur opzuivering door kolomchromatografie.............................................. 24
2.6. RNA-opzuiveringstechnieken ................................................................................. 26
2.7. kwantificatie van DNA-en RNA-moleculen .............................................................. 27
2.8. fysicochemische eigenschappen van dna-moleculen ............................................. 28
2.9. gel-eletroforese van NZ .......................................................................................... 30
2.10. kwantificatie van DNA en rna .................................................................................. 32
2.11. capilliare gel elektroforese (cge) ............................................................................. 35
2.12. recuperatie NZ uit de gel ........................................................................................ 37
H3: Polymerase chain reaction (pcr) ...................................................................................... 38
3.1. de essentiële componenten en PCR-reactiestappen ............................................... 38
3.2. kritische factoren bij het uitvoeren van pcr .............................................................. 39
3.3. Cycli aantal- plateau-effect .................................................................................... 40
3.4. thermostabiele DNA-polymerase ........................................................................... 40
3.5. de primerparen ...................................................................................................... 40
3.6. het reactie midden ................................................................................................. 43
3.7. de matrijs .............................................................................................................. 43
3.8. multiplex pcr.......................................................................................................... 43
3.9. asymmetrische pcr ................................................................................................ 44
3.10. verhoging van pcr-specificiteit ................................................................................ 45
3.11. kolonie-pcr ............................................................................................................ 47
H4: enzymen van de recombinant Dna-technologie ................................................................ 47
4.1. nucleasen.............................................................................................................. 47
1
,Zoë Swinnen
4.2. het immuunsysteem van bacteriën ......................................................................... 50
4.3. restrictie-endonucleasen ....................................................................................... 51
4.4. opsproren RE knip plaatsen .................................................................................... 53
4.5. resctrictieanalyse- fysische kartering...................................................................... 54
4.6. bijzondere aspecten............................................................................................... 55
4.7. omzetting blunt naar cohesieve uiteinden ............................................................... 58
4.8. omzetting cohesieve naar blunt uiteinden ............................................................... 59
4.9. andere manipulatie enzymen ................................................................................. 59
H5: kloneringsstrategiën-speciale vectoren en gist gastheer ................................................... 60
5.1. kloneren met RE..................................................................................................... 60
5.2. TA- en gc-klonering ................................................................................................ 60
5.3. kloneren van blunt fragmenten ............................................................................... 62
5.4. kloneren door naadloze dna-assemblage ............................................................... 62
5.5. genen banken ........................................................................................................ 64
5.6. cdna bank aanmaak ............................................................................................... 64
5.7. specifieke vectoren voor sense en anti-sense RNa-moleculen................................. 65
5.8. specifieke vectoren voor sense en antisense dna moleculen ................................... 65
5.9. expressie vectoren ................................................................................................. 66
5.10. gist en eukaryote gastheercel-vector systeem ......................................................... 67
H6: detectie door hybridisatie technieken .............................................................................. 70
6.1. screening door Southern hybridisatie ...................................................................... 70
6.2. label en detectie van het toets dna ......................................................................... 72
6.3. interne labeling van toets dna ................................................................................. 75
6.4. eindstandige label op het toets dna ........................................................................ 77
6.5. northern blotting .................................................................................................... 77
6.6. dot blot hybridisatie ............................................................................................... 80
6.7. kolonie hybridisatie voor detectie van vibrio’s ......................................................... 81
6.8. ISH-technieken voor chromosoom analyse ............................................................. 81
H7: identificatie technieken in diagnostiek en (forenisch) onderzoek ....................................... 86
7.1. restrictie fragment lengte polymorfisme-pcr (rflp-pcr) ............................................. 86
7.2. dna-profilering en fingerprint analyse ...................................................................... 87
7.3. diagostische testen met AMP-flp-pcr ...................................................................... 89
7.4. ola-pcr-ligation voor detectie van puntmutaties ...................................................... 91
7.5. detectie microsatelliet instabiliteit ......................................................................... 92
7.6. multiplex-single tube nested pcr en detectie van plasmodium infecties ................... 94
2
, Zoë Swinnen
8. DNa-sequentie analyse .................................................................................................. 95
8.1. de dideoxysequenering methode ............................................................................ 95
8.2. bepaling van nucleotide variantie via sanger sequenering ........................................ 97
9. pharmacogenomics en micro-array ................................................................................ 97
9.1. de studie van de farmacogenoomanalyse ............................................................... 97
9.2. verwerking van geneesmiddelen ............................................................................. 97
9.3. SNps en haplotypen en genotypes- hapmap project ................................................ 97
9.4. micro-array technologie of dna-chip analyse........................................................... 99
3
BIOTECHNOLOGIE
Theorie
Zoë Swinnen
,Zoë Swinnen
INHOUD
H1: Recombinant technologie en vector systemen in E.coli ......................................................4
1.1. Basisprincipes van de recombinant DNA-technologie ...............................................4
1.2. Biologische gastheren in moleculaire biotechnologie ................................................5
1.3. ontwikkeling van een vector......................................................................................6
1.4. Enzymen betrokken bij de klonering ..........................................................................7
1.5. DNA-inbreng methoden voor gastheercellen .............................................................9
1.6. Kolonie screening en selectiemerker ...................................................................... 10
1.7. Courante kloneringsvectoren ................................................................................. 13
H2: Nucleinezuur scheidingstechnieken ................................................................................ 16
2.1. Algemene principes nucleïnzuur opzuiveringstechnieken ........................................ 16
2.2. Chromosomaal DNA isolatie uit prokaryoten (bacteriën) ......................................... 16
2.3. Alkalische-SDS lyse methode voor plasmiden uit E.coli ........................................... 22
2.4. Eukaryoot genomisch DNA-isolatie......................................................................... 23
2.5. Nucleïnezuur opzuivering door kolomchromatografie.............................................. 24
2.6. RNA-opzuiveringstechnieken ................................................................................. 26
2.7. kwantificatie van DNA-en RNA-moleculen .............................................................. 27
2.8. fysicochemische eigenschappen van dna-moleculen ............................................. 28
2.9. gel-eletroforese van NZ .......................................................................................... 30
2.10. kwantificatie van DNA en rna .................................................................................. 32
2.11. capilliare gel elektroforese (cge) ............................................................................. 35
2.12. recuperatie NZ uit de gel ........................................................................................ 37
H3: Polymerase chain reaction (pcr) ...................................................................................... 38
3.1. de essentiële componenten en PCR-reactiestappen ............................................... 38
3.2. kritische factoren bij het uitvoeren van pcr .............................................................. 39
3.3. Cycli aantal- plateau-effect .................................................................................... 40
3.4. thermostabiele DNA-polymerase ........................................................................... 40
3.5. de primerparen ...................................................................................................... 40
3.6. het reactie midden ................................................................................................. 43
3.7. de matrijs .............................................................................................................. 43
3.8. multiplex pcr.......................................................................................................... 43
3.9. asymmetrische pcr ................................................................................................ 44
3.10. verhoging van pcr-specificiteit ................................................................................ 45
3.11. kolonie-pcr ............................................................................................................ 47
H4: enzymen van de recombinant Dna-technologie ................................................................ 47
4.1. nucleasen.............................................................................................................. 47
1
,Zoë Swinnen
4.2. het immuunsysteem van bacteriën ......................................................................... 50
4.3. restrictie-endonucleasen ....................................................................................... 51
4.4. opsproren RE knip plaatsen .................................................................................... 53
4.5. resctrictieanalyse- fysische kartering...................................................................... 54
4.6. bijzondere aspecten............................................................................................... 55
4.7. omzetting blunt naar cohesieve uiteinden ............................................................... 58
4.8. omzetting cohesieve naar blunt uiteinden ............................................................... 59
4.9. andere manipulatie enzymen ................................................................................. 59
H5: kloneringsstrategiën-speciale vectoren en gist gastheer ................................................... 60
5.1. kloneren met RE..................................................................................................... 60
5.2. TA- en gc-klonering ................................................................................................ 60
5.3. kloneren van blunt fragmenten ............................................................................... 62
5.4. kloneren door naadloze dna-assemblage ............................................................... 62
5.5. genen banken ........................................................................................................ 64
5.6. cdna bank aanmaak ............................................................................................... 64
5.7. specifieke vectoren voor sense en anti-sense RNa-moleculen................................. 65
5.8. specifieke vectoren voor sense en antisense dna moleculen ................................... 65
5.9. expressie vectoren ................................................................................................. 66
5.10. gist en eukaryote gastheercel-vector systeem ......................................................... 67
H6: detectie door hybridisatie technieken .............................................................................. 70
6.1. screening door Southern hybridisatie ...................................................................... 70
6.2. label en detectie van het toets dna ......................................................................... 72
6.3. interne labeling van toets dna ................................................................................. 75
6.4. eindstandige label op het toets dna ........................................................................ 77
6.5. northern blotting .................................................................................................... 77
6.6. dot blot hybridisatie ............................................................................................... 80
6.7. kolonie hybridisatie voor detectie van vibrio’s ......................................................... 81
6.8. ISH-technieken voor chromosoom analyse ............................................................. 81
H7: identificatie technieken in diagnostiek en (forenisch) onderzoek ....................................... 86
7.1. restrictie fragment lengte polymorfisme-pcr (rflp-pcr) ............................................. 86
7.2. dna-profilering en fingerprint analyse ...................................................................... 87
7.3. diagostische testen met AMP-flp-pcr ...................................................................... 89
7.4. ola-pcr-ligation voor detectie van puntmutaties ...................................................... 91
7.5. detectie microsatelliet instabiliteit ......................................................................... 92
7.6. multiplex-single tube nested pcr en detectie van plasmodium infecties ................... 94
2
, Zoë Swinnen
8. DNa-sequentie analyse .................................................................................................. 95
8.1. de dideoxysequenering methode ............................................................................ 95
8.2. bepaling van nucleotide variantie via sanger sequenering ........................................ 97
9. pharmacogenomics en micro-array ................................................................................ 97
9.1. de studie van de farmacogenoomanalyse ............................................................... 97
9.2. verwerking van geneesmiddelen ............................................................................. 97
9.3. SNps en haplotypen en genotypes- hapmap project ................................................ 97
9.4. micro-array technologie of dna-chip analyse........................................................... 99
3
