Moleculaire genetica en
epigenetica
ZSO 2: Bibliotheken (genomische,
chromosomaal, cDNA)
Achtergrond
Nucleotide sequentie van een genoom is gekend individueel gen kan makkelijk
geïsoleerd worden en in grote aantallen geproduceerd worden
Recombinant DNA technologie: de mogelijkheid om DNA te manipuleren met
precisie in een testbuisje of een organisme
- Splitsen van DNA op specifieke plaatsen door restrictie nuclease
- DNA ligatie: mogelijk om 2 stukken DNA samen te voegen
- DNA kloning: het maken van identieke kopieën van een DNA fragment of
het isoleren van een DNA fragment door vele kopieën van enkel dat
fragment te maken
- Hybridisatie van nucleïnezuur: specifieke sequenties van DNA of RNA
identificeren
- DNA synthese: chemisch synthetiseren van DNA met eender welke
sequentie
- Snelle bepaling van een sequentie van nucleotiden van DNA of RNA
Genetische ziektes
1 genmutatie kan effect hebben op de functie van een enzym soms grote
gevolgen
Phenylketonuria
= een recessieve mutatie van het gen voor phenylalanine hydroxylase op de
lange arm van chromosoom 12
1
, Phenylalamine kan niet omgezet worden in tyrosine
Phenylalamine = een essentiëel aminozuur, moet gehaald worden uit de voeding
- Te veel aan phenylalamine wordt omgezet naar phenylpyruvic zuur
- Schadelijk voor de cellen van het centraal zenuwstelsel ernstige
mentale aftakeling, trage groei, vroege dood
Tyrosine wordt niet aangemaakt, nodig voor proteïne synthese, productie van
thyroxine, adrenaline en melanine
- Patiënten hebben een lichte huid en blauwe ogen
Behandeling: opletten op de voeding zodat er niet te veel en te weinig
phenylalamine wordt opgenomen
- Genoeg voor de normale ontwikkeling van het zenuwstelsel
- Niet te veel voor de mentale aftakeling
- Moet beginnen 1 à 2 maanden na de geboorte
- Voor zwangere vrouwen ook voor en tijdens de zwangerschap dit dieet
aanhouden
Albinisme
= een autosomaal recessieve mutatie
- In het gen dat tyrosinase maakt (zet tyrosine om in DOPA bruine
pigment hiervan afkomstig)
- Ook andere mutaties mogelijk
Ouders die beide albinisme hebben maar mutaties hebben op andere
genen kunnen wel normale kinderen krijgen
Melanine absorbeert ultraviolet licht + beschermt de huid tegen schadelijke UV
straling
Symptomen: witte huid, wit haar en rode ogen + gevoelig voor het licht
Sickelcel anemie
= een autosomale mutatie
- In het gen dat hemoglobine maakt homozygoot voor de mutatie =
sickelcel anemie ; heterozygoot voor de mutatie = sickelcel trait
- De vorm van rode bloedcellen verandert waardoor ze fragieler worden en
minder soepel
o Leidt tot anemie
- Hebben vele gezondheidsproblemen
Mucovisidose
= autosomaal recessieve ziekte
- Deletie in het gen dat een Cl- kanaal maakt
- Taai slijm gemaakt (problemen pancreas, luchtwegsysteem en
spijsverteringssysteem)
- Behandeling: kloppen op de borst en rug + antibiotica voor infecties
DNA bibliotheken
Def. een verzameling van DNA-fragmenten die in vectoren zijn gekloneerd, zodat
onderzoekers die DNA-fragmenten die hen interesseren kunnen identificeren,
isoleren en verder analyseren
Waarom?
Een genoom is veel te groot om te sequencen
2
, 1 chromosoom heeft meer dan 250 miljoen basenparen
DNA labelen: DNA polymerasen met nucleotiden die de modificatie hebben
Aanmaak van bibliotheken
1) Extractie van het DNA
2) DNA in stukjes knippen met behulp van:
o Restrictie endonuclease: knippen het DNA op specifieke plaatsen
onder de juiste omstandigheden niet volledige vertering van het
DNA
Kan direct gebruikt worden in een cloning vector
o Mechanische stuk maken: geluidsgolven, naald, …
Moet eerst nog sticky ends krijgen voor het in een vector kan
! overlappende stukjes van geschikte grote vormen anders:
- Een specifieke regio dat bestudeert moet worden kan 1 of meer
plaatsen voor het restrictie-enzym bevatten in stukken en niet
meer bruikbaar
- Grote van de fragmenten is meestal klein vele genen zijn
groter + heel veel recombinant DNA
- Aantal base tussen de restrictieplaatsen is variabel sommige
stukken te groot en niet kloonbaar
- Geen idee hoe de stukken achter elkaar passen veel
informatie verloren
3) Van elk DNA fragment vele kopieën maken
o DNA fragment in een plasmide vector (met ligase samengevoegd)
o Transformatie = plasmide in een bacterie brengen
o Als bacterie vermenigvuldigt, vermenigvuldigt het DNA fragment
mee
Heel snel vele kopieën maken van een stukje DNA
4) De DNA fragmenten gesorteerd op basis van grote met behulp van
gelelektroforese
Een kloningsvector of plasmide:
- Cirkelvormig, dubbelstrengig DNA molecule
- Kan opgenomen worden in een gastheer
- Kan je DNA-fragment plakken (dichtplakken met ligase)
- Kan mee vermenigvuldigd worden
- Vaak E. Coli gebruikt met slechts 1 à 2 bacteriële artificiële
chromosomen
o Stabiel, kan grote stukken DNA bevatten, makkelijk te gebruiken
Controle of het gen is opgenomen
lacZ gen op de plaats waar het DNA wordt ingebracht
o gen intact, geen DNA ingebracht, lacZ geproduceert, kolonie is
blauw
o gen niet intact, DNA ingebracht, geen lacZ geproduceert, kolonie is
wit
Antibiotica resistent gen aanwezig
o Plasmide ingebracht in de gastheer, gastheer kan overleven in een
milieu met antibiotica
1 kolonie bevat vele kopieën van 1 specifiek stukje DNA
Genomische bibliotheek: stelt het volledig genomisch DNA van een organisme
voor
3
epigenetica
ZSO 2: Bibliotheken (genomische,
chromosomaal, cDNA)
Achtergrond
Nucleotide sequentie van een genoom is gekend individueel gen kan makkelijk
geïsoleerd worden en in grote aantallen geproduceerd worden
Recombinant DNA technologie: de mogelijkheid om DNA te manipuleren met
precisie in een testbuisje of een organisme
- Splitsen van DNA op specifieke plaatsen door restrictie nuclease
- DNA ligatie: mogelijk om 2 stukken DNA samen te voegen
- DNA kloning: het maken van identieke kopieën van een DNA fragment of
het isoleren van een DNA fragment door vele kopieën van enkel dat
fragment te maken
- Hybridisatie van nucleïnezuur: specifieke sequenties van DNA of RNA
identificeren
- DNA synthese: chemisch synthetiseren van DNA met eender welke
sequentie
- Snelle bepaling van een sequentie van nucleotiden van DNA of RNA
Genetische ziektes
1 genmutatie kan effect hebben op de functie van een enzym soms grote
gevolgen
Phenylketonuria
= een recessieve mutatie van het gen voor phenylalanine hydroxylase op de
lange arm van chromosoom 12
1
, Phenylalamine kan niet omgezet worden in tyrosine
Phenylalamine = een essentiëel aminozuur, moet gehaald worden uit de voeding
- Te veel aan phenylalamine wordt omgezet naar phenylpyruvic zuur
- Schadelijk voor de cellen van het centraal zenuwstelsel ernstige
mentale aftakeling, trage groei, vroege dood
Tyrosine wordt niet aangemaakt, nodig voor proteïne synthese, productie van
thyroxine, adrenaline en melanine
- Patiënten hebben een lichte huid en blauwe ogen
Behandeling: opletten op de voeding zodat er niet te veel en te weinig
phenylalamine wordt opgenomen
- Genoeg voor de normale ontwikkeling van het zenuwstelsel
- Niet te veel voor de mentale aftakeling
- Moet beginnen 1 à 2 maanden na de geboorte
- Voor zwangere vrouwen ook voor en tijdens de zwangerschap dit dieet
aanhouden
Albinisme
= een autosomaal recessieve mutatie
- In het gen dat tyrosinase maakt (zet tyrosine om in DOPA bruine
pigment hiervan afkomstig)
- Ook andere mutaties mogelijk
Ouders die beide albinisme hebben maar mutaties hebben op andere
genen kunnen wel normale kinderen krijgen
Melanine absorbeert ultraviolet licht + beschermt de huid tegen schadelijke UV
straling
Symptomen: witte huid, wit haar en rode ogen + gevoelig voor het licht
Sickelcel anemie
= een autosomale mutatie
- In het gen dat hemoglobine maakt homozygoot voor de mutatie =
sickelcel anemie ; heterozygoot voor de mutatie = sickelcel trait
- De vorm van rode bloedcellen verandert waardoor ze fragieler worden en
minder soepel
o Leidt tot anemie
- Hebben vele gezondheidsproblemen
Mucovisidose
= autosomaal recessieve ziekte
- Deletie in het gen dat een Cl- kanaal maakt
- Taai slijm gemaakt (problemen pancreas, luchtwegsysteem en
spijsverteringssysteem)
- Behandeling: kloppen op de borst en rug + antibiotica voor infecties
DNA bibliotheken
Def. een verzameling van DNA-fragmenten die in vectoren zijn gekloneerd, zodat
onderzoekers die DNA-fragmenten die hen interesseren kunnen identificeren,
isoleren en verder analyseren
Waarom?
Een genoom is veel te groot om te sequencen
2
, 1 chromosoom heeft meer dan 250 miljoen basenparen
DNA labelen: DNA polymerasen met nucleotiden die de modificatie hebben
Aanmaak van bibliotheken
1) Extractie van het DNA
2) DNA in stukjes knippen met behulp van:
o Restrictie endonuclease: knippen het DNA op specifieke plaatsen
onder de juiste omstandigheden niet volledige vertering van het
DNA
Kan direct gebruikt worden in een cloning vector
o Mechanische stuk maken: geluidsgolven, naald, …
Moet eerst nog sticky ends krijgen voor het in een vector kan
! overlappende stukjes van geschikte grote vormen anders:
- Een specifieke regio dat bestudeert moet worden kan 1 of meer
plaatsen voor het restrictie-enzym bevatten in stukken en niet
meer bruikbaar
- Grote van de fragmenten is meestal klein vele genen zijn
groter + heel veel recombinant DNA
- Aantal base tussen de restrictieplaatsen is variabel sommige
stukken te groot en niet kloonbaar
- Geen idee hoe de stukken achter elkaar passen veel
informatie verloren
3) Van elk DNA fragment vele kopieën maken
o DNA fragment in een plasmide vector (met ligase samengevoegd)
o Transformatie = plasmide in een bacterie brengen
o Als bacterie vermenigvuldigt, vermenigvuldigt het DNA fragment
mee
Heel snel vele kopieën maken van een stukje DNA
4) De DNA fragmenten gesorteerd op basis van grote met behulp van
gelelektroforese
Een kloningsvector of plasmide:
- Cirkelvormig, dubbelstrengig DNA molecule
- Kan opgenomen worden in een gastheer
- Kan je DNA-fragment plakken (dichtplakken met ligase)
- Kan mee vermenigvuldigd worden
- Vaak E. Coli gebruikt met slechts 1 à 2 bacteriële artificiële
chromosomen
o Stabiel, kan grote stukken DNA bevatten, makkelijk te gebruiken
Controle of het gen is opgenomen
lacZ gen op de plaats waar het DNA wordt ingebracht
o gen intact, geen DNA ingebracht, lacZ geproduceert, kolonie is
blauw
o gen niet intact, DNA ingebracht, geen lacZ geproduceert, kolonie is
wit
Antibiotica resistent gen aanwezig
o Plasmide ingebracht in de gastheer, gastheer kan overleven in een
milieu met antibiotica
1 kolonie bevat vele kopieën van 1 specifiek stukje DNA
Genomische bibliotheek: stelt het volledig genomisch DNA van een organisme
voor
3
