Moleculaire ontwikkelingsbiologie
1. Inleiding
Toepassingen van ontwikkelingsbiologie:
● Stamceldifferentiatie
● Interpretatie van congenitale defecten
● Evolutie & devolutie begrijpen
De 3 kiemlagen genereren alle somatische celtypes
→ geslachtscellen of hun voorlopers ontstaan uit een aparte set cellen
Verschillende stadia in de dierlijke ontwikkeling:
1. Klieving = snelle mitotische delingen ⇒ blastomeren ⇒ blastula
2. Gastrula = blastocoel + 3 kiemlagen
3. Organogenese
4. Gametogenese
5. Larve-stadium ≠ adult stadium
→ niet bij alle dieren
Bestemmingskaarten tonen de bestemming van elke cel binnen het embryo
→ met fotoactiveerbare fluorescente kleurstof
→ overeenkomsten tussen veel verschillende adulte stadia
→ cellen die de notochord vormen betrekken een centraal-dorsale positie
→ precursoren van neurale cellen liggen anterieur van de notochord
→ neuraal ectoderm is omgeven door toekomstige epidermis
2. Algemene werkconcepten in de ontwikkeling
Celdeling, patroonvorming, morfogenese, celdifferentiatie & -groei
Ontwikkeling = toenemende organisatie vanuit een groepje cellen
Snelle klievingsdelingen na de bevruchting
Patroonvorming = spatiale & temporele organisatie van activiteiten van cellen door een verscheidenheid aan
cellulaire & moleculaire mechanismen
Lichaamsassen worden gedefinieerd ⇒ lichaamsbouwplan
Morfogenese = verandering van vorm
→ door gastrulatie & celmigratie
Celdifferentiatie is sterk verweven met patroonvorming
Activiteit van genen & ontwikkelingsprocessen
De genexpressie status van de cel bepaalt het gedrag van die cel
→ gedrag bepaalt de embryonale ontwikkeling
→ intercellulaire signalisatie, verandering van adhesie, vorm, motiliteit, celproliferatie & celdood
Controle van de eiwitproductie
Huishoudeiwitten worden in elk celtype geëxpresseerd
Controle over eiwitproductie:
, ● Stabilisatie van mRNAs
● Posttranslationele modificaties
● Transcriptiefactoren
● Aantal genen
Differentiële gen activiteit
Genomische equivalentie <-> differentiële gen activiteit
Genexpressie is de eerste stap in de cascade van cellulaire processen
→ niet de enige eigenschap van ontwikkeling, ook vorm & interacties zijn belangrijk
Celbestemming
Determinatie van cellen in de kiemlagen ⇒ stabiele verandering in de cel
→ onderscheid tussen bestemming van een cel in een bepaald stadium & de determinatie-toestand van een cel
→ cellen die uitgewisseld worden naar een andere regio nemen ofwel een nieuwe vorm aan of ontwikkelen zoals op
hun oorspronkelijke plek
Specificatie van cellen
→ houdt geen determinatie in
→ animale pool ⇒ ectoderm ⇒ epidermis
→ vegetale pool ⇒ mesoderm
Inductieve interacties
Inducerende signalen kunnen heel lokaal of over een grote groep van cellen werken
→ via diffusie, direct contact of gap junctions
→ competentie van de responderende cel is belangrijk
→ Spemann organisator kan slechts veranderingen induceren over een beperkte tijd
Antwoord op inducerende signalen
De responderende cel is beperkt in het aantal mogelijke antwoorden
→ inducerend signaal selecteert een bepaald antwoord
→ eenzelfde set signaalmoleculen kunnen totaal verschillende antwoorden uitlokken
→ afhankelijk van het stadium in de ontwikkeling
Patronen & positionele informatie
Cellen ontwikkelen vaak volgens hun posities langs de embryonale as
→ reageren op gesecreteerde factor (= morfogen)
→ diffundeert vanaf de plaats waar hij wordt aangemaakt tot de plaats waar hij wordt afgebroken
→ morfogradiënt ⇒ cellen in een weefsel hebben typische reactie op basis van de concentratie
Laterale inhibitie
Patronen kunnen gegenereerd worden door de expressie en/of secretie van een inhiberende substantie
→ bv. cellen die een veer vormen verhinderen cellen in hun onmiddelijke omgeving om dit ook te doen
Localisatie van cytoplasmatische determinanten & asymmetrische delingen
Een patroon genereren uit een bevrucht ei kan ook via asymmetrische distributie van chemische componenten
gevolgd door delingen ⇒ mozaïsche ontwikkeling
Embryo bevat eerder een genererend dan een beschrijvend programma
Alle informatie voor de embryonale ontwikkeling zit in de bevruchte eicel
,Een descriptief programma beschrijft het resultaat
Een genererend programma levert de instructies om bepaalde structuren te maken
3. Genen & ontwikkeling
Alle cellen in een embryo/adult zijn genomisch equivalent ⇒ klonen
→ wel differentiële genexpressie
Bestudering van de genfunctie:
● Expressiestudies
○ Nagaan waar het gen tot expressie komt tijdens de verschillende ontwikkelingsstadia
○ In situ hybridisatie
○ Western/Northern blot
○ Q-RT-PCR
○ Microarray
○ RNASeq
○ Single-cell RNAseq
● Loss-of-function experimenten
○ Gen uitschakelen of expressie tijdelijk onderdrukken
○ Gen knockdown
■ RNAi
■ Morpholino
○ Gen knockout
■ Homologie recombinatie
→ conditioneel of induceerbaar
■ Mutagenese
■ TALEN
■ CRISPR/Cas
● Gain-of-function experimenten
○ Gen tot expressie brengen op een verkeerd tijdstip, plaats of met constitutieve activiteit
○ Tijdelijke over/misexpressie
■ RNA, DNA of proteïne micro-injecties
■ Electroporatie of in vivo transfectie
○ Permanente of induceerbare over/misexpressie
■ Transgenese
4.Cellulaire basis van de morfogenese
Morfogenese wordt bepaald door:
● Richting en aantal celdelingen
● Verandering van celvorm
● Celbeweging
● Celgroei
● Celdood
● Verandering in samenstelling van ECM & celmembraan
Cellulaire communicatie gebeurt via oplosbare factoren & contacten
, Differentiële cel affiniteit ⇒ morfogenetische veranderingen
→ reaggregatie van kiembladen
→ spatiale segregatie & embryonale positionering
→ selectieve affiniteit: binnenoppervlak van het ectoderm heeft een positieve affiniteit voor het
mesoderm en negatieve affiniteit voor het endoderm
→ verandert gedurende de ontwikkeling
→ thermodynamisch model van cel interacties
→ gevolg van celadhesie & genexpressie
→ in vivo evidentie voor differentiële adhesie hypothese
→ adhesieve hiërarchie correleert met cohesiekrachten
→ uitsortering op basis van aantal adhesiemoleculen op de celmembraan (= kwantitatieve verschillen)
→ intercallatie van cellen in functie van de adhesie-gradiënt
→ uitsortering op basis van aard van adhesiemoleculen (= kwalitatieve verschillen)
→ sterkte van de celadhesie wordt ook bepaald door clustering in de membraan, verankering met het
cytoskelet of met de aanwezigheid van actomyosine contractiele kabels
5.Cel-cel communicatie tijdens de ontwikkeling
Inductie & competentie
Weefsels moeten competent zijn om te reageren op inductieve signalen
→ inducer vs. responder
→ bv. Pax6-deficiënte ratten hebben geen lens inductie → competentie hangt af van Pax6
Reciproke inductie = eens een bepaald weefsel geïnduceerd is, kan dit op zijn beurt andere weefsels induceren of
beïnvloeden
Epithelen zijn aaneengesloten cellen in bladen of buizen met sterke intercellulaire interacties
Mesenchymale cellen zijn los georganiseerd, vaak zonder cel-cel contact
Regionale specificiteit van inductie: de aard van structuren word bepaald door de identiteit van het mesenchym
Genetische specificiteit van inductie: mesenchymale instructies kunnen de barrière tussen species kruisen maar
antwoord van responderende weefsels kan wel genetisch vastliggen
Paracriene factoren
Sommige inductieve signalen zijn oplosbare factoren (paracriene interacties), andere vereisen een fysieke interactie
tussen 2 interagerende cellen (juxtacriene interactie)
Embryo gebruikt vaak dezelfde factoren voor de aanmaak van totaal verchillende organen
4 groepen van paracriene factoren:
● Fibroblast growth factor (FGF) familie
○ 12-tal genen & 100den isovormen in vertebraten
○ Betrokken bij angiogenese, inductie van het mesoderm, vorming van ledematen, middenhersenen &
axon extensie
○ Functioneel redundant maar hebben wel een gerestricteerd expressie patroon
○ Signaaltransductie via RTK pathway
● Hedgehog familie
○ Betrokken bij inductie van welbepaalde celtypes & scheppen grenzen tussen weefsels
○ Shh in vertebraten
■ notochord is een voorname bron
→ patroonvorming in neurale buis & van de somieten
1. Inleiding
Toepassingen van ontwikkelingsbiologie:
● Stamceldifferentiatie
● Interpretatie van congenitale defecten
● Evolutie & devolutie begrijpen
De 3 kiemlagen genereren alle somatische celtypes
→ geslachtscellen of hun voorlopers ontstaan uit een aparte set cellen
Verschillende stadia in de dierlijke ontwikkeling:
1. Klieving = snelle mitotische delingen ⇒ blastomeren ⇒ blastula
2. Gastrula = blastocoel + 3 kiemlagen
3. Organogenese
4. Gametogenese
5. Larve-stadium ≠ adult stadium
→ niet bij alle dieren
Bestemmingskaarten tonen de bestemming van elke cel binnen het embryo
→ met fotoactiveerbare fluorescente kleurstof
→ overeenkomsten tussen veel verschillende adulte stadia
→ cellen die de notochord vormen betrekken een centraal-dorsale positie
→ precursoren van neurale cellen liggen anterieur van de notochord
→ neuraal ectoderm is omgeven door toekomstige epidermis
2. Algemene werkconcepten in de ontwikkeling
Celdeling, patroonvorming, morfogenese, celdifferentiatie & -groei
Ontwikkeling = toenemende organisatie vanuit een groepje cellen
Snelle klievingsdelingen na de bevruchting
Patroonvorming = spatiale & temporele organisatie van activiteiten van cellen door een verscheidenheid aan
cellulaire & moleculaire mechanismen
Lichaamsassen worden gedefinieerd ⇒ lichaamsbouwplan
Morfogenese = verandering van vorm
→ door gastrulatie & celmigratie
Celdifferentiatie is sterk verweven met patroonvorming
Activiteit van genen & ontwikkelingsprocessen
De genexpressie status van de cel bepaalt het gedrag van die cel
→ gedrag bepaalt de embryonale ontwikkeling
→ intercellulaire signalisatie, verandering van adhesie, vorm, motiliteit, celproliferatie & celdood
Controle van de eiwitproductie
Huishoudeiwitten worden in elk celtype geëxpresseerd
Controle over eiwitproductie:
, ● Stabilisatie van mRNAs
● Posttranslationele modificaties
● Transcriptiefactoren
● Aantal genen
Differentiële gen activiteit
Genomische equivalentie <-> differentiële gen activiteit
Genexpressie is de eerste stap in de cascade van cellulaire processen
→ niet de enige eigenschap van ontwikkeling, ook vorm & interacties zijn belangrijk
Celbestemming
Determinatie van cellen in de kiemlagen ⇒ stabiele verandering in de cel
→ onderscheid tussen bestemming van een cel in een bepaald stadium & de determinatie-toestand van een cel
→ cellen die uitgewisseld worden naar een andere regio nemen ofwel een nieuwe vorm aan of ontwikkelen zoals op
hun oorspronkelijke plek
Specificatie van cellen
→ houdt geen determinatie in
→ animale pool ⇒ ectoderm ⇒ epidermis
→ vegetale pool ⇒ mesoderm
Inductieve interacties
Inducerende signalen kunnen heel lokaal of over een grote groep van cellen werken
→ via diffusie, direct contact of gap junctions
→ competentie van de responderende cel is belangrijk
→ Spemann organisator kan slechts veranderingen induceren over een beperkte tijd
Antwoord op inducerende signalen
De responderende cel is beperkt in het aantal mogelijke antwoorden
→ inducerend signaal selecteert een bepaald antwoord
→ eenzelfde set signaalmoleculen kunnen totaal verschillende antwoorden uitlokken
→ afhankelijk van het stadium in de ontwikkeling
Patronen & positionele informatie
Cellen ontwikkelen vaak volgens hun posities langs de embryonale as
→ reageren op gesecreteerde factor (= morfogen)
→ diffundeert vanaf de plaats waar hij wordt aangemaakt tot de plaats waar hij wordt afgebroken
→ morfogradiënt ⇒ cellen in een weefsel hebben typische reactie op basis van de concentratie
Laterale inhibitie
Patronen kunnen gegenereerd worden door de expressie en/of secretie van een inhiberende substantie
→ bv. cellen die een veer vormen verhinderen cellen in hun onmiddelijke omgeving om dit ook te doen
Localisatie van cytoplasmatische determinanten & asymmetrische delingen
Een patroon genereren uit een bevrucht ei kan ook via asymmetrische distributie van chemische componenten
gevolgd door delingen ⇒ mozaïsche ontwikkeling
Embryo bevat eerder een genererend dan een beschrijvend programma
Alle informatie voor de embryonale ontwikkeling zit in de bevruchte eicel
,Een descriptief programma beschrijft het resultaat
Een genererend programma levert de instructies om bepaalde structuren te maken
3. Genen & ontwikkeling
Alle cellen in een embryo/adult zijn genomisch equivalent ⇒ klonen
→ wel differentiële genexpressie
Bestudering van de genfunctie:
● Expressiestudies
○ Nagaan waar het gen tot expressie komt tijdens de verschillende ontwikkelingsstadia
○ In situ hybridisatie
○ Western/Northern blot
○ Q-RT-PCR
○ Microarray
○ RNASeq
○ Single-cell RNAseq
● Loss-of-function experimenten
○ Gen uitschakelen of expressie tijdelijk onderdrukken
○ Gen knockdown
■ RNAi
■ Morpholino
○ Gen knockout
■ Homologie recombinatie
→ conditioneel of induceerbaar
■ Mutagenese
■ TALEN
■ CRISPR/Cas
● Gain-of-function experimenten
○ Gen tot expressie brengen op een verkeerd tijdstip, plaats of met constitutieve activiteit
○ Tijdelijke over/misexpressie
■ RNA, DNA of proteïne micro-injecties
■ Electroporatie of in vivo transfectie
○ Permanente of induceerbare over/misexpressie
■ Transgenese
4.Cellulaire basis van de morfogenese
Morfogenese wordt bepaald door:
● Richting en aantal celdelingen
● Verandering van celvorm
● Celbeweging
● Celgroei
● Celdood
● Verandering in samenstelling van ECM & celmembraan
Cellulaire communicatie gebeurt via oplosbare factoren & contacten
, Differentiële cel affiniteit ⇒ morfogenetische veranderingen
→ reaggregatie van kiembladen
→ spatiale segregatie & embryonale positionering
→ selectieve affiniteit: binnenoppervlak van het ectoderm heeft een positieve affiniteit voor het
mesoderm en negatieve affiniteit voor het endoderm
→ verandert gedurende de ontwikkeling
→ thermodynamisch model van cel interacties
→ gevolg van celadhesie & genexpressie
→ in vivo evidentie voor differentiële adhesie hypothese
→ adhesieve hiërarchie correleert met cohesiekrachten
→ uitsortering op basis van aantal adhesiemoleculen op de celmembraan (= kwantitatieve verschillen)
→ intercallatie van cellen in functie van de adhesie-gradiënt
→ uitsortering op basis van aard van adhesiemoleculen (= kwalitatieve verschillen)
→ sterkte van de celadhesie wordt ook bepaald door clustering in de membraan, verankering met het
cytoskelet of met de aanwezigheid van actomyosine contractiele kabels
5.Cel-cel communicatie tijdens de ontwikkeling
Inductie & competentie
Weefsels moeten competent zijn om te reageren op inductieve signalen
→ inducer vs. responder
→ bv. Pax6-deficiënte ratten hebben geen lens inductie → competentie hangt af van Pax6
Reciproke inductie = eens een bepaald weefsel geïnduceerd is, kan dit op zijn beurt andere weefsels induceren of
beïnvloeden
Epithelen zijn aaneengesloten cellen in bladen of buizen met sterke intercellulaire interacties
Mesenchymale cellen zijn los georganiseerd, vaak zonder cel-cel contact
Regionale specificiteit van inductie: de aard van structuren word bepaald door de identiteit van het mesenchym
Genetische specificiteit van inductie: mesenchymale instructies kunnen de barrière tussen species kruisen maar
antwoord van responderende weefsels kan wel genetisch vastliggen
Paracriene factoren
Sommige inductieve signalen zijn oplosbare factoren (paracriene interacties), andere vereisen een fysieke interactie
tussen 2 interagerende cellen (juxtacriene interactie)
Embryo gebruikt vaak dezelfde factoren voor de aanmaak van totaal verchillende organen
4 groepen van paracriene factoren:
● Fibroblast growth factor (FGF) familie
○ 12-tal genen & 100den isovormen in vertebraten
○ Betrokken bij angiogenese, inductie van het mesoderm, vorming van ledematen, middenhersenen &
axon extensie
○ Functioneel redundant maar hebben wel een gerestricteerd expressie patroon
○ Signaaltransductie via RTK pathway
● Hedgehog familie
○ Betrokken bij inductie van welbepaalde celtypes & scheppen grenzen tussen weefsels
○ Shh in vertebraten
■ notochord is een voorname bron
→ patroonvorming in neurale buis & van de somieten
