Biotechnologie
1. Recombinant technologie en vector systemen
Basisprincipes van de recombinant DNA-technologie
- = overdracht van genetische informatie van het ene naar het andere organisme
- Recombinante cloning procedure via plasmiden (bv. E.coli) -> vreemd DNA voor de bacterie
isoleren (in vitro)
- Knippen gebeurd met endonucleasen
- Gen van interesse invoegen (knippen + plakken) (vb. genen: resistentie, waterzuivering,
hormonale groei, …) = recombinant DNA plasmide
- + DNA behouden in gastheer (= transformeren) à recombinante bacterie (opgroeien in
medium)+ kloonvorming (°kolonie)
- Workflow van recombinante klonering
o Vector voorbereiding (+ restrictie endonucleasen)
o Insert voorbereiden
o Ligatie
o Transformatie/elektroporatie (mbv elektro competentie) à E.coli kan niet zomaar
naakt DNA opnemen à cellen competent maken
o Kolonies screening à selectiemerker
Biologische gastheren in moleculaire biotechnologie
- E.coli (gram negatief) à K12 strain of B stam à veroorzaakt geen infecties + antibiotica
sensitief (reden: screenen met antibiotica resistentie)
- Suikers typisch voor gram negatieve bacteriën, osachariden typisch voor E.coli (lipide A
draagt suikerketens)
- De periplasmatische ruimte bevat veel afbraakenzymen
Ontwikkeling van een vector
- Vectoren = transportmiddel (relaxed control vectoren + hoog kopij, veel verschillende
soorten) à kloneringsvectoren (vehicle + transporter)
- Fagemiden = vectoren afgeleid van fagen
- Replicatie oorsprong voor uni- en bidirectioneel (enkel E.coli, plasmiden kunnen beiden)
o OriC -> chromosoom (van de bacterie)
o OriV -> vector/plasmide
- Copy number = aantal plasmiden die worden gevormd
- Incompatibility group -> eenzelfde groep kan niet worden gecombineerd à cotransformatie
(met 2 vectoren) mogen dus niet van dezelfde groep zijn
- pBR322 = prototype van verschillende andere vectoren + voorloper van pUC = pMB1
, - cosmide = plasmide + cos side van lambda-faag
- MAC en YAC = lineaire chromosomen
- De inserten van vectoren verschillen (= hoeveelheid DNA ze kunnen opnemen)
- Vectoren zijn zelf niet mobiel à missen OriT (missen genen om de transfer uit te oefenen)
o Geen ongewilde verspreidingen van vreemd DNA
o Vector mis
§ Bom/nic/oriT: mobilisatie, transfer en plaats van de nick
§ Mob: mobiliteit gen (aanhechtingsplaats voor mobiliteitseiwitten
§ Tra: transfer gen
- Vectoren hebben unieke knipplaatsen (onder de vorm van een polylinker -> makkelijke
klonering)
o bamH1: lineair maken
o restrictie endonucleasen voor klonering (1x vector knippen) + geclusterd in MCS
(multiple cloning site)
- vectoren dragen selecteerbare merkers
o antibiotica resistentie (ampicilline, tetracycline en chlooramfenicol) à cellen worden
resistent waardoor ze het plasmiden willen houden (de bacterie kan blijven groeien
op een medium met antibiotica)
- vectoren voorzien van specifieke sequenties om manipulaties mogelijk te maken
Enzymen betrokken bij klonering
- blunt ends (er wordt even geknipt in beide strengen) (vaak in palindromen) -> moeilijker
aaneenhechting door afwezigheid stabiliserende delen)
- sticky ends (vaak in palindromen) -> kunnen achteraf makkelijk worden gelieerd
o 5’ overhang/ 3’ recessed (via BamH1 = restrictie enzym zoals Mba1)
o 5’ recessed/ 3’ overhang
- Fragmentlengten worden bepaald door de herkenningssequenties (vormen restrictiekaart)
- Naamgeving
o Eiwitten met hoofdletters vs. genen met kleine letters + cursief
o Genus(hoofdletter) – eerste 2 letters van de species naam(kleine letters) – Romeins
cijfer om verschillende enzymen uit hetzelfde organismen te onderscheiden
- Strengen worden nooit 100% geknipt (95-5) à het ongeknipte blijft aanwezig en zorgt voor
achtergrond
- Nevenmoleculen van ligatie reacties
o Zelfsluiting door identieke uiteinden
o Intermoleculaire ligatie (geen replicatie door te snelle afbraak)
o Intramoleculaire ligatie à ruis (bevat ook ongeknipt) dus moet geminimaliseerd
worden (kan wel worden verwijderd in tegenstelling tot ongeknipte delen)
- Intramoleculaire ligatie tegengaan à defosforylering van vector DNA (enkel OH groepen) à
ligasen kunnen niet werken à ruggengraat niet volledig à daling achtergrond (geen
zelfsluiting) (met behulp van fosfatasen)
niet bij verschillende uiteinden (geen sluiting mogelijk)
- Courante ligasen: DNA ligasen en T4 DNA ligase à niet alle nicks kunnen worden gesloten
(door defosforylering: 2/4)
,DNA-inbreng methoden voor gastheercellen
- 3 processen van gentransfer
o Transformatie à opname van naakt DNA door gastheercel
o Transductie à chromosomaal DNA transfereren van de ene naar de andere cel
o Conjugatie à overdracht met behulp van een pilus van de ene naar de andere cel
- Natuurlijke competente species (waarin natuurlijke transformaties plaatsvinden):
streptococcus, staphylococcus, haemophillus en pseudomonas
- Transfectie à bacteriële cellen worden door viraal afgeleide vectoren getransformeerd +
intrede van nucleïnezuren bij de opname van DNA of RNA in dierlijke cellen door niet-virale
systemen
- Suikerketens (lipide A) van gram negatieve celwanden dragen fosfaatgroepen à buitenlaag
negatief (afstoting met DNA), calcium neutraliseert deze lading (geen afstoting)
- Transformaties mogelijk via chemisch gebaseerde carriers (competent maken) via
elektroporatie, calciumfosfaat, calciumchloride, magnesium fosfaat,…
- Bacteriecellen competent maken: ijskoude hypotonische calciumchloride oplossing
o Cellen minder mobiel
o Cel neemt water op à zwelt maar zal niet barsten + bevat watermantel (vorming
van sferoplasten bevorderen door intact binnenmembraan + openen
buitenmembraan)
o Door incubatie in koude wordt DNA opgenomen à hitteshock (42°) à
temperatuurverschillen zorgen voor het binnenstromen van het DNA à uitplaten op
ijs, getransformeerde moleculen groeien uit tot kolonies
- Transformatie door elektroporatie (exogeen DNA)
o Mbv zeer zuiver water (geen zoutoplossing) à ligatie (cellen + DNA) mix in cuvet à
toestel levert elektrische shock à °pulsgradiënt over membraan à °watergevulde
kanalen in binnenmembraan voor DNA opname
o Screenen van cellen mbv selectiemerkers à fenotypes uitschakelen die ongewild zijn
- In een opgroeiend medium à herstel – vermenigvuldiging en expressie (mbv selecties)
- SOCK voor herstel en aanrijking
- Niet elke cel neemt een plasmide op (medium + antibiotica doden cellen zonder resistentie)
- Diegene die recombinant construct opnemen à groei (populaties nu van elkaar
onderscheiden)
Kolonie screening en selectiemerker
- Transpeptidase bij celdeling à zorgt voor crosslinking
- Opname van alanine residu’s in actief centrum van transpeptidase
- Antibiotica interactie met peptidoglycaanlaag à vanaf deze is gevormd kan penicilline de cel
niet meer afdoden
- Ampicilline = irreversibele competitieve inhibitor van transpeptidase à alanine kan niet
meer gebonden worden à geen vorming peptidoglycaanlaag à celdood
- PGN (onderdeel van de celwand) beschermt tegen osmotische lyse van de bacterie
- Ampicilline bindt aan serine residu van transpeptidase
, - Werking ampicilline à competitie door binding in katalytische pocket aan serine residu’s
o Bla-gen codeert voor bèta-lactamase à hydrolyseert bèta-lactam ring van
ampicilline à geen inhibitie transpeptidase (niet getransformeerd = celdood,
wanneer de peptidoglycaanlaag is aangemaakt blijft de cel leven)
- Werking tetracycline à bindt aan 30S (16S rRNA) à amino-acyl tRN bindt niet meer op A
plaats à inhibitie translatie, geen eiwitvorming en celdood (voorkomen door vector +
tetracycline resistentie gen, vector + tet-gen à °membraaneiwitten om tetracycline uit de
cel te pompen)
- Werking chloramphenicol à inhibitie thv 50S (5S rRNA + 23 rRNA) à 23S (bevat
peptidyltransferase activiteit) wordt geïnhibeerd à chloramphenicol acetyl transferase =
resistentiegen door aanbrengen acetylgroepen à inhibitie chloramphenicol
- Synthese metabolietgenen = soort selectiemerker
o Auxotroof à zelf aanmaken van een specifiek metaboliet, missen een actief gen bv
histidine aanmaak (obv hiervan selecties maken)
§ Detectie: cellen laten groeien + histidine op groeimedium à replicaplating
(diegene die histidine bevat is identiek aan de moederplaat en de andere kan
worden vergeleken waar de auxotrofen groeien)
o Prototroof à zelfstandig synthese pas uitvoeren à kan alles zelf aanmaken
- Supressor = stopcodon dat wordt doorgelezen (mutatie + mutatie = wildtype)
Courante kloneringsvectoren
- pBR322 (plasmide – onderzoeker – numerieke verwijzing)
o pSC101 gemaakt uit R6 (natuurlijke plasmiden -> veel antibiotica resistentie
(tetracycline))
o pMB1 gemaakt uit col E1
o Tn3 (ampicilline resistentie)
• ° uit 3 natuurlijke isolaten
- pBR322 bevat geen kloneringsplaats + GAATTC = startplaats met eerste T = 1
- replica plating techniek => insertionele inactivatie van 1 van de resistentie genen
(recombinant stuk wordt getransformeerd naar gastheercellen + uitgeplaat op selectief
medium)
o gastheercellen zonder vectoropname à afgedood op selectief medium door
antibiotica
o transformanten (opname lege vector) in achtergrond aanwezig (door zelfsluiting van
niet gedefosforyleerde vectoren)
o screening juiste transformanten à opname recombinante vector (replica plating om
onderscheid te maken tussen transformaten met of zonder insert opname)
• alles wat een vector opneemt heeft aanleiding tot het vormen van kolonies =
positieve screening
• negatieve screening à van master plaat naar 2e plaat (replica plating) + 2
antibiotica à diegene die groeit is niet gewenst (enkel transformanten met
lege vector -> zonder insert)à diegene die wel gewenst is kan worden
gevonden door vergelijking met de moederplaat
- pUC18/19 (verschillen in oriëntatie van de polylinker)
o multiple kloneringsside in het lac operon + bèta lactamase resistentie gen
1. Recombinant technologie en vector systemen
Basisprincipes van de recombinant DNA-technologie
- = overdracht van genetische informatie van het ene naar het andere organisme
- Recombinante cloning procedure via plasmiden (bv. E.coli) -> vreemd DNA voor de bacterie
isoleren (in vitro)
- Knippen gebeurd met endonucleasen
- Gen van interesse invoegen (knippen + plakken) (vb. genen: resistentie, waterzuivering,
hormonale groei, …) = recombinant DNA plasmide
- + DNA behouden in gastheer (= transformeren) à recombinante bacterie (opgroeien in
medium)+ kloonvorming (°kolonie)
- Workflow van recombinante klonering
o Vector voorbereiding (+ restrictie endonucleasen)
o Insert voorbereiden
o Ligatie
o Transformatie/elektroporatie (mbv elektro competentie) à E.coli kan niet zomaar
naakt DNA opnemen à cellen competent maken
o Kolonies screening à selectiemerker
Biologische gastheren in moleculaire biotechnologie
- E.coli (gram negatief) à K12 strain of B stam à veroorzaakt geen infecties + antibiotica
sensitief (reden: screenen met antibiotica resistentie)
- Suikers typisch voor gram negatieve bacteriën, osachariden typisch voor E.coli (lipide A
draagt suikerketens)
- De periplasmatische ruimte bevat veel afbraakenzymen
Ontwikkeling van een vector
- Vectoren = transportmiddel (relaxed control vectoren + hoog kopij, veel verschillende
soorten) à kloneringsvectoren (vehicle + transporter)
- Fagemiden = vectoren afgeleid van fagen
- Replicatie oorsprong voor uni- en bidirectioneel (enkel E.coli, plasmiden kunnen beiden)
o OriC -> chromosoom (van de bacterie)
o OriV -> vector/plasmide
- Copy number = aantal plasmiden die worden gevormd
- Incompatibility group -> eenzelfde groep kan niet worden gecombineerd à cotransformatie
(met 2 vectoren) mogen dus niet van dezelfde groep zijn
- pBR322 = prototype van verschillende andere vectoren + voorloper van pUC = pMB1
, - cosmide = plasmide + cos side van lambda-faag
- MAC en YAC = lineaire chromosomen
- De inserten van vectoren verschillen (= hoeveelheid DNA ze kunnen opnemen)
- Vectoren zijn zelf niet mobiel à missen OriT (missen genen om de transfer uit te oefenen)
o Geen ongewilde verspreidingen van vreemd DNA
o Vector mis
§ Bom/nic/oriT: mobilisatie, transfer en plaats van de nick
§ Mob: mobiliteit gen (aanhechtingsplaats voor mobiliteitseiwitten
§ Tra: transfer gen
- Vectoren hebben unieke knipplaatsen (onder de vorm van een polylinker -> makkelijke
klonering)
o bamH1: lineair maken
o restrictie endonucleasen voor klonering (1x vector knippen) + geclusterd in MCS
(multiple cloning site)
- vectoren dragen selecteerbare merkers
o antibiotica resistentie (ampicilline, tetracycline en chlooramfenicol) à cellen worden
resistent waardoor ze het plasmiden willen houden (de bacterie kan blijven groeien
op een medium met antibiotica)
- vectoren voorzien van specifieke sequenties om manipulaties mogelijk te maken
Enzymen betrokken bij klonering
- blunt ends (er wordt even geknipt in beide strengen) (vaak in palindromen) -> moeilijker
aaneenhechting door afwezigheid stabiliserende delen)
- sticky ends (vaak in palindromen) -> kunnen achteraf makkelijk worden gelieerd
o 5’ overhang/ 3’ recessed (via BamH1 = restrictie enzym zoals Mba1)
o 5’ recessed/ 3’ overhang
- Fragmentlengten worden bepaald door de herkenningssequenties (vormen restrictiekaart)
- Naamgeving
o Eiwitten met hoofdletters vs. genen met kleine letters + cursief
o Genus(hoofdletter) – eerste 2 letters van de species naam(kleine letters) – Romeins
cijfer om verschillende enzymen uit hetzelfde organismen te onderscheiden
- Strengen worden nooit 100% geknipt (95-5) à het ongeknipte blijft aanwezig en zorgt voor
achtergrond
- Nevenmoleculen van ligatie reacties
o Zelfsluiting door identieke uiteinden
o Intermoleculaire ligatie (geen replicatie door te snelle afbraak)
o Intramoleculaire ligatie à ruis (bevat ook ongeknipt) dus moet geminimaliseerd
worden (kan wel worden verwijderd in tegenstelling tot ongeknipte delen)
- Intramoleculaire ligatie tegengaan à defosforylering van vector DNA (enkel OH groepen) à
ligasen kunnen niet werken à ruggengraat niet volledig à daling achtergrond (geen
zelfsluiting) (met behulp van fosfatasen)
niet bij verschillende uiteinden (geen sluiting mogelijk)
- Courante ligasen: DNA ligasen en T4 DNA ligase à niet alle nicks kunnen worden gesloten
(door defosforylering: 2/4)
,DNA-inbreng methoden voor gastheercellen
- 3 processen van gentransfer
o Transformatie à opname van naakt DNA door gastheercel
o Transductie à chromosomaal DNA transfereren van de ene naar de andere cel
o Conjugatie à overdracht met behulp van een pilus van de ene naar de andere cel
- Natuurlijke competente species (waarin natuurlijke transformaties plaatsvinden):
streptococcus, staphylococcus, haemophillus en pseudomonas
- Transfectie à bacteriële cellen worden door viraal afgeleide vectoren getransformeerd +
intrede van nucleïnezuren bij de opname van DNA of RNA in dierlijke cellen door niet-virale
systemen
- Suikerketens (lipide A) van gram negatieve celwanden dragen fosfaatgroepen à buitenlaag
negatief (afstoting met DNA), calcium neutraliseert deze lading (geen afstoting)
- Transformaties mogelijk via chemisch gebaseerde carriers (competent maken) via
elektroporatie, calciumfosfaat, calciumchloride, magnesium fosfaat,…
- Bacteriecellen competent maken: ijskoude hypotonische calciumchloride oplossing
o Cellen minder mobiel
o Cel neemt water op à zwelt maar zal niet barsten + bevat watermantel (vorming
van sferoplasten bevorderen door intact binnenmembraan + openen
buitenmembraan)
o Door incubatie in koude wordt DNA opgenomen à hitteshock (42°) à
temperatuurverschillen zorgen voor het binnenstromen van het DNA à uitplaten op
ijs, getransformeerde moleculen groeien uit tot kolonies
- Transformatie door elektroporatie (exogeen DNA)
o Mbv zeer zuiver water (geen zoutoplossing) à ligatie (cellen + DNA) mix in cuvet à
toestel levert elektrische shock à °pulsgradiënt over membraan à °watergevulde
kanalen in binnenmembraan voor DNA opname
o Screenen van cellen mbv selectiemerkers à fenotypes uitschakelen die ongewild zijn
- In een opgroeiend medium à herstel – vermenigvuldiging en expressie (mbv selecties)
- SOCK voor herstel en aanrijking
- Niet elke cel neemt een plasmide op (medium + antibiotica doden cellen zonder resistentie)
- Diegene die recombinant construct opnemen à groei (populaties nu van elkaar
onderscheiden)
Kolonie screening en selectiemerker
- Transpeptidase bij celdeling à zorgt voor crosslinking
- Opname van alanine residu’s in actief centrum van transpeptidase
- Antibiotica interactie met peptidoglycaanlaag à vanaf deze is gevormd kan penicilline de cel
niet meer afdoden
- Ampicilline = irreversibele competitieve inhibitor van transpeptidase à alanine kan niet
meer gebonden worden à geen vorming peptidoglycaanlaag à celdood
- PGN (onderdeel van de celwand) beschermt tegen osmotische lyse van de bacterie
- Ampicilline bindt aan serine residu van transpeptidase
, - Werking ampicilline à competitie door binding in katalytische pocket aan serine residu’s
o Bla-gen codeert voor bèta-lactamase à hydrolyseert bèta-lactam ring van
ampicilline à geen inhibitie transpeptidase (niet getransformeerd = celdood,
wanneer de peptidoglycaanlaag is aangemaakt blijft de cel leven)
- Werking tetracycline à bindt aan 30S (16S rRNA) à amino-acyl tRN bindt niet meer op A
plaats à inhibitie translatie, geen eiwitvorming en celdood (voorkomen door vector +
tetracycline resistentie gen, vector + tet-gen à °membraaneiwitten om tetracycline uit de
cel te pompen)
- Werking chloramphenicol à inhibitie thv 50S (5S rRNA + 23 rRNA) à 23S (bevat
peptidyltransferase activiteit) wordt geïnhibeerd à chloramphenicol acetyl transferase =
resistentiegen door aanbrengen acetylgroepen à inhibitie chloramphenicol
- Synthese metabolietgenen = soort selectiemerker
o Auxotroof à zelf aanmaken van een specifiek metaboliet, missen een actief gen bv
histidine aanmaak (obv hiervan selecties maken)
§ Detectie: cellen laten groeien + histidine op groeimedium à replicaplating
(diegene die histidine bevat is identiek aan de moederplaat en de andere kan
worden vergeleken waar de auxotrofen groeien)
o Prototroof à zelfstandig synthese pas uitvoeren à kan alles zelf aanmaken
- Supressor = stopcodon dat wordt doorgelezen (mutatie + mutatie = wildtype)
Courante kloneringsvectoren
- pBR322 (plasmide – onderzoeker – numerieke verwijzing)
o pSC101 gemaakt uit R6 (natuurlijke plasmiden -> veel antibiotica resistentie
(tetracycline))
o pMB1 gemaakt uit col E1
o Tn3 (ampicilline resistentie)
• ° uit 3 natuurlijke isolaten
- pBR322 bevat geen kloneringsplaats + GAATTC = startplaats met eerste T = 1
- replica plating techniek => insertionele inactivatie van 1 van de resistentie genen
(recombinant stuk wordt getransformeerd naar gastheercellen + uitgeplaat op selectief
medium)
o gastheercellen zonder vectoropname à afgedood op selectief medium door
antibiotica
o transformanten (opname lege vector) in achtergrond aanwezig (door zelfsluiting van
niet gedefosforyleerde vectoren)
o screening juiste transformanten à opname recombinante vector (replica plating om
onderscheid te maken tussen transformaten met of zonder insert opname)
• alles wat een vector opneemt heeft aanleiding tot het vormen van kolonies =
positieve screening
• negatieve screening à van master plaat naar 2e plaat (replica plating) + 2
antibiotica à diegene die groeit is niet gewenst (enkel transformanten met
lege vector -> zonder insert)à diegene die wel gewenst is kan worden
gevonden door vergelijking met de moederplaat
- pUC18/19 (verschillen in oriëntatie van de polylinker)
o multiple kloneringsside in het lac operon + bèta lactamase resistentie gen
