Samenvatting HT 9 display technieken - Farmaceutische biotechnologie (K0B04A)

HOOFDSTUK 9: DISPLAY TECHNIEKEN

Introductie:

Display technieken:
= Tot expressie brengen v eiwitten of peptiden op de celwand/-membraan ve organisme (‘to display’)

- Doel (meestal): die organismen selecteren die binden aan gewenste target
o Deze organismen ‘displayen’ een eiwit dat bindt aan gewenste target
o Bevatten ook coderende DNA
o DNA kan geamplificeerd worden en seq bepaald  eiwitseq = gekend
- Eiwitten = vaak antilichamen of antilichaam fragmenten (halve blauwe maantjes)
- Principe:
o Antilichamen/fragmentjes op bacteriën of gisten tot expressie brengen
o Je wil weten: bindt eiwit (antilichaam) aan antigen (eiwit v interesse)
o Antigen linken aan bv magnetische beads
o Via magneet: scheiden v organismen die wel of nt gebonden zijn aan eiwit v
interesse
o Organisme opgroeien  cel delen en delen  DNA sequencen
o Obv DNAseq weten welk eiwit op mantel zat




Faagdisplay:

Faagdisplay:
- Meest gebruikte display techniek
- Alternatieven: gist display, zoogdierceldisplay, ribosomal display, …
- Bacteriofagen:
= virussen met bacteriële gastheren
o Knn bacteriën infecteren
o Onschadelijk voor hogere organismen zoals gist & zoogdieren
o Meest voorkomende organisme op planeet
o Overal waar bacteriën leven zijn fagen
o Lytische (bv. T7) en nt-lytische fagen (bv. M13)
 Nt lytische: knn infecteren maar bacterie gaat er zelf nt van dood
Faagdisplay – M13:
- Nt-lytische fagen
- Opbouw faagpartikel:
o 5 structurele eiwitten
 pIII, pVI, pVII, pVIII en pIX
 pVIII: heel veel kopijen, pIII heeft er 5
o Binnenin stukje DNA

, - Filamenteuze faag:
o Staafvormig, circulair ssDNA, 10 genen
o Grootte genoom: 6400 bp
o Diameter: 7nm / lengte 700 tot 2000 nm, heel lang
- Levenscyclus M13 faag:
o M13 fagen infecteren bacterie
 pIII eiwit v faag bindt aan f-pilus bacterie
o Genoom geïnjecteerd in bacterie (opgenomen in bacterie)
 ssDNA komt vrij
 Bacterie: ssDNA  dsDNA (via bacterieel DNApol)
o Amplificatie faag genoom (bacterieel DNApol, zoals plasmide)
o Faag genoom codeert voor benodigde faag eiwitten (bacterieel RNA pol)
 overgeschreven
o Nieuwe faagpartikels geassembleerd (mbv faag eiwitten)
o Uit cel getransporteerd, zonder lysis v bacterie (nt lytische)
- Faag opp bestaat uit eiwitten, meestal: (afh v wat we willen doen)
o Kandidaat peptiden gefusioneerd aan pVIII
 pVIII: ~2000 kopijen/faag
 Sterische hinder igv grotere eiwitten
o Kandidaat eiwitten (antilichamen) gefusioneerd aan pIII
 pIII: tot 5 kopijen/faag
 Faag nt heel groot, geen groot antilichaam binden  koppelen aan pIII
- Eiwitten tentoon gesteld (‘display’)
- Fusie:
o Zorgen dat seq die coderen voor eiw in genoom v faag zit
o Genetisch, via klassieke kloneringstechnieken (i.e.restrictie
digest/ligatie)
 Eiwit v interesse in dsDNA plakken
o Kan doordat ssDNA  dsDNA tijdens bacteriële infectie
- In praktijk nt gewerkt met volledige faag genoom, maar met faagmide
o Nt perse nood om continu nieuwe faagpartikels te bekomen
- Faagmide:
o Plasmide waarop delen faag genoom aanwezig zijn
o Nt volledige genoom  geen faagvorming bij bacteriële transformatie
o Minimaal nodig:
 Bacteriële ORI: voor replicatie dsDNA na transformatie
 Faag ORI: dsDNA  ssDNA
 Om DNA in te knn bouwen in faagpartikel
 Resistentiegen
 Expressiecassette:
 Promoter
 Signaal peptide
 Multiple cloning site (MCS): bib aan eiwitten of peptide in te
kloneren
 Deel faag manteleiwit (pIII of pVIII)
 !!! Eiwitten in zelfde leesraam als signaal peptide en pIII gen
o Oorsprong bibliotheken:
 Natuurlijke:
 bv. antilichaam seq
 Synthetische: