HPLC
STAALVOORBEREIDING
= hoe stalen aanbrengen op de HPLC
De te bepalen verbinding moet:
1) zo zuiver mogelijk op kolom gebracht worden
vrij zijn van vaste deeltjes
Start eluens van mobiele fase gebruik je liefst als solvent
altijd eerst blanco injecteren
INJECTIE VERSCHILLENDE VORMEN
Bulk = standaarden (als dusdanig) die je oplost in eluens of zeer gelijkend solvens
Waterige oplossingen Injecteren na verdunning
(druppels, siroop) niet waterig eluens: eerst extractie doen zodat e geen fase-scheiding hebt
Tabletten en capsules Oplossen en zo nodig filteren
centrifugeren kan ook: dan bovenstaandje vloeistof injecteren
centrifugeren > filteren als stof aan filter adsorbeert
Zalven en crèmes Stof eruit halen mbv extractie en dan injecteren
VERMIJDEN KOLOM BEVUILING
= technieken zodat staal zo zuiver mogelijk op kolom komt
opzuivering staal
gradiënt elutie met was-fase
regeneratie kolom als het echt niet anders kan
gebruik ‘pre’kolommen (guard column)
o liefst in zelfde samenstelling als eigenlijke HPLC kolom
o deze kolom zit voor HPLC kolom om alle ‘rommel’ op te vangen
o na een tijd: prekolom vervangen
o nieuwe prekolom is goedkoper dan een nieuwe kolom
1 OPZUIVERING STAAL
= afhankelijk van stof: zuur, base…
= via extractie: scheiding op basis van pKa en oplosbaarheidsprofielen
met pH spelen zodat stof die je eruit wil halen niet geladen is en naar organische fase gaat en
de rest in water
terug pH aanpassen zodat die wel geladen: stof zit in waterige fase
bv bij C18 kolom kan je dan gewoon injecteren
7
, Nog opzuiveringstechnieken:
Vriesdrogen concentratie verhogen = alles geconcentreerder injecteren
Uitzouten spelen met oplosbaarheid van componenten
o waterige fase polairder maken door zouten te maken -> oplosbaarheid daalt
o hierdoor slaan er meer eiwitten neer
o componenten gedwongen naar organische fase
SPE ook gebruik om staal op te zuiveren
Ionenpaar extractie geladen base in water: gaat nooit naar organisch solvent
tegenionen toevoegen = ionpairing = oplosbaar in organisch solvent -> base kan zo geisoleerd
worden
tegenion bv octaan sulfonzuur
Eiwit neerslag kan bij bloedstalen
organisch solvent toevoegen aan staal -> centrifugeren -> bovenstaande laag injecteren
2 ISOKRATISCHE OF GRADIËNT ELUTIE MET WASFASE
W rood = wasfase
x-as = tijd
A y-as = % organische fase
S
F
A deel isokratisch nemen en dan wasfase inlassen =
S naar zeer hoge hoeveelheid organische fase gaan
dan: terug naar initiële condities en stabiliseren
E o moet zodat je volgend experiment met
zelfde conditie start, anders is er te veel invloed van organische fase -> elutie is dan
te snel waardoor je geen retentie hebt
Wanneer kolom regeneratie?
wanneer kolom niet meer performant is
kolom reinigen met reeks van solventen (water-methanol-acetonitrile-propanol-
dichloromethaan) door kolom achterstevoren te draaien solventen moeten mengbaar zijn
dan terug reinigen met die solvent maar in andere richting
8
STAALVOORBEREIDING
= hoe stalen aanbrengen op de HPLC
De te bepalen verbinding moet:
1) zo zuiver mogelijk op kolom gebracht worden
vrij zijn van vaste deeltjes
Start eluens van mobiele fase gebruik je liefst als solvent
altijd eerst blanco injecteren
INJECTIE VERSCHILLENDE VORMEN
Bulk = standaarden (als dusdanig) die je oplost in eluens of zeer gelijkend solvens
Waterige oplossingen Injecteren na verdunning
(druppels, siroop) niet waterig eluens: eerst extractie doen zodat e geen fase-scheiding hebt
Tabletten en capsules Oplossen en zo nodig filteren
centrifugeren kan ook: dan bovenstaandje vloeistof injecteren
centrifugeren > filteren als stof aan filter adsorbeert
Zalven en crèmes Stof eruit halen mbv extractie en dan injecteren
VERMIJDEN KOLOM BEVUILING
= technieken zodat staal zo zuiver mogelijk op kolom komt
opzuivering staal
gradiënt elutie met was-fase
regeneratie kolom als het echt niet anders kan
gebruik ‘pre’kolommen (guard column)
o liefst in zelfde samenstelling als eigenlijke HPLC kolom
o deze kolom zit voor HPLC kolom om alle ‘rommel’ op te vangen
o na een tijd: prekolom vervangen
o nieuwe prekolom is goedkoper dan een nieuwe kolom
1 OPZUIVERING STAAL
= afhankelijk van stof: zuur, base…
= via extractie: scheiding op basis van pKa en oplosbaarheidsprofielen
met pH spelen zodat stof die je eruit wil halen niet geladen is en naar organische fase gaat en
de rest in water
terug pH aanpassen zodat die wel geladen: stof zit in waterige fase
bv bij C18 kolom kan je dan gewoon injecteren
7
, Nog opzuiveringstechnieken:
Vriesdrogen concentratie verhogen = alles geconcentreerder injecteren
Uitzouten spelen met oplosbaarheid van componenten
o waterige fase polairder maken door zouten te maken -> oplosbaarheid daalt
o hierdoor slaan er meer eiwitten neer
o componenten gedwongen naar organische fase
SPE ook gebruik om staal op te zuiveren
Ionenpaar extractie geladen base in water: gaat nooit naar organisch solvent
tegenionen toevoegen = ionpairing = oplosbaar in organisch solvent -> base kan zo geisoleerd
worden
tegenion bv octaan sulfonzuur
Eiwit neerslag kan bij bloedstalen
organisch solvent toevoegen aan staal -> centrifugeren -> bovenstaande laag injecteren
2 ISOKRATISCHE OF GRADIËNT ELUTIE MET WASFASE
W rood = wasfase
x-as = tijd
A y-as = % organische fase
S
F
A deel isokratisch nemen en dan wasfase inlassen =
S naar zeer hoge hoeveelheid organische fase gaan
dan: terug naar initiële condities en stabiliseren
E o moet zodat je volgend experiment met
zelfde conditie start, anders is er te veel invloed van organische fase -> elutie is dan
te snel waardoor je geen retentie hebt
Wanneer kolom regeneratie?
wanneer kolom niet meer performant is
kolom reinigen met reeks van solventen (water-methanol-acetonitrile-propanol-
dichloromethaan) door kolom achterstevoren te draaien solventen moeten mengbaar zijn
dan terug reinigen met die solvent maar in andere richting
8
