Urine onderzoek
Week 3
Doel.
Het identificeren van de bacterie soort van urine monsters 30 en 60 door
middel van biochemische testen en het bekijken van de resistentie door de
agar-diffusie methode.
Inleiding.
Identificeren gram positieve staven en gram negatieve coccen.
Resistentiebepaling volgens de agar-diffusiemethode
Van een reinkweek van een geïsoleerde bacterie wordt een suspensie
gemaakt in bouillon. Na enkele uren groei in de broedstoof bij 37 °C wordt
de troebeling van de suspensie m.b.v. een steriel 0,85% NaCl-oplossing
gelijk gemaakt aan die van de standaard McFarland 0,5. De suspensie
bevat dan ongeveer 1 * 108 bacteriën / ml. De suspensie wordt met een
steriele wattendrager zodanig geënt op een Mueller Hinton agarplaat, dat
later na bebroeden een confluente groei is ontstaan. Op de plaat worden met
een pincet steriel schijfjes opgebracht. Elk schijfje bevat een bepaald
antibioticum in een bepaalde concentratie (µg/ml). Vanuit het schijfje
begint het antibioticum meteen in de voedingsbodem te diffunderen. De
concentratie van het antibioticum neemt met toenemende afstand tot het
schijfje af en wel logaritmisch. Op een bepaalde afstand van het schijfje
zal de concentratie zo laag zijn geworden dat de bacterie niet meer in de
groei wordt onderdrukt. Op dit punt ontstaat een scherpe grens tussen een
gebied zonder zichtbare groei (groeiremmingszone) en een gebied met
bacteriegroei. De diameter van de remmingszones wordt gemeten en in de
tabel met kritische remmingszonediameters wordt opgezocht of de bacterie
gevoelig (S), matig gevoelig (I) of ongevoelig (R) is voor de betreffende
antibiotica. In de tabel kan men ook zien of de bacterie op urineniveau
gevoelig of ongevoelig is voor het antibioticum. De agardiffusiemethode
is alleen geschikt voor snelgroeiende bacteriën. Dezevormen binnen 24 uur
zichtbare kolonies. Voor de gevoeligheidsbepaling van langzaam groeiende
bacteriën zoals bv. de tuberkelbacterie en obligaat anaërobe bacteriën
moet een andere methode bv. de agarverdunningsmethode worden
gebruikt.
De minimum remmende concentratie
, De minimum remmende concentratie (MRC of MIC = minimal inhibition
concentration) is de laagste concentratie van een anti-microbieel middel
waarbij een micro-organisme geremd wordt in zijn groei. De MRC voor een
micro-organisme wordt als volgt bepaald. In een serie buizen of in de cups
van een microtiterplaten, maakt men een verdunningsreeks van het anti-
microbiële middel in een vloeibaar medium, zodat men een afnemende
concentratie van dat middel in serie verkrijgt. In elk van de buizen ent
men dezelfde hoeveelheid van de te onderzoeken bacteriestam. Na 18 uur
incubatie stelt men vast in welke buizen het medium helder is (waarin dus
de bacteriestam niet macroscopisch zichtbaar is gegroeid) en in welke
buizen het medium troebel is (waarin de bacteriestam wel is gegroeid). De
heldere buis die voorafgaat aan de eerste buis met troebel medium bevat
de concentratie waarbij de bacterie geremd wordt. Dit is de MRC van het
antibioticum t.o.v. de bacteriestam die uitgedrukt wordt in microgrammen
per milliliter (µg/ml).
De minimum dodende concentratie
In dezelfde reeks buizen kan men ook de minimale concentratie, die de
bacteriestam gedood heeft, vaststellen. Hiertoe ent men de inhoud van de
heldere buizen van de reeks op een vast medium, bijvoorbeeld een
bloedplaat, en neemt na 18 uur incubatie waarop welk van de platen groei
van de bacteriestam is ontstaan. De laatste onbegroeide plaat van de
reeks is beent vanuit de buis die de concentratie anti-microbieel middel
bevat waarbij de bacterie gedood wordt. Dit is de MBC (minimal
bactericidal concentration) van het antibioticum t.o.v. de bacteriestam,
eveneens uitgedrukt in µg/ml. Hoe lager dus de MRC en de MBC van een
anti-microbieel middel voor een micro-organisme, hoe lager ook de
therapeutische dosis van het middel kan zijn.
PCR 16s rRNA genen
Materiaal en methode.
Biochemische testen.
Uit de agar platen en gramkleuring is gebleken dat er bij urine monster 30
waarschijnlijk een gram positieve coccen aanwezig zijn. Dit bleek uit de
groei op de CNA plaat, ook door de blauwe bacterie kolonies op de UTI
plaat, dit wijst op beta-glucosidase enzym activiteit, wat wijst op
enterococci bacterie. Ook uit de gramkleuring waren er gram positieve
coccen te zien in druiventros formatie. Om te bevestigen dat deze bacterie
enterococcen zijn worden de volgende testen uitgevoerd: Katalase test, Bile-
esculin hydrolyse; Sorbitol, arabinose, trehalose en mannitol test. Stel
Week 3
Doel.
Het identificeren van de bacterie soort van urine monsters 30 en 60 door
middel van biochemische testen en het bekijken van de resistentie door de
agar-diffusie methode.
Inleiding.
Identificeren gram positieve staven en gram negatieve coccen.
Resistentiebepaling volgens de agar-diffusiemethode
Van een reinkweek van een geïsoleerde bacterie wordt een suspensie
gemaakt in bouillon. Na enkele uren groei in de broedstoof bij 37 °C wordt
de troebeling van de suspensie m.b.v. een steriel 0,85% NaCl-oplossing
gelijk gemaakt aan die van de standaard McFarland 0,5. De suspensie
bevat dan ongeveer 1 * 108 bacteriën / ml. De suspensie wordt met een
steriele wattendrager zodanig geënt op een Mueller Hinton agarplaat, dat
later na bebroeden een confluente groei is ontstaan. Op de plaat worden met
een pincet steriel schijfjes opgebracht. Elk schijfje bevat een bepaald
antibioticum in een bepaalde concentratie (µg/ml). Vanuit het schijfje
begint het antibioticum meteen in de voedingsbodem te diffunderen. De
concentratie van het antibioticum neemt met toenemende afstand tot het
schijfje af en wel logaritmisch. Op een bepaalde afstand van het schijfje
zal de concentratie zo laag zijn geworden dat de bacterie niet meer in de
groei wordt onderdrukt. Op dit punt ontstaat een scherpe grens tussen een
gebied zonder zichtbare groei (groeiremmingszone) en een gebied met
bacteriegroei. De diameter van de remmingszones wordt gemeten en in de
tabel met kritische remmingszonediameters wordt opgezocht of de bacterie
gevoelig (S), matig gevoelig (I) of ongevoelig (R) is voor de betreffende
antibiotica. In de tabel kan men ook zien of de bacterie op urineniveau
gevoelig of ongevoelig is voor het antibioticum. De agardiffusiemethode
is alleen geschikt voor snelgroeiende bacteriën. Dezevormen binnen 24 uur
zichtbare kolonies. Voor de gevoeligheidsbepaling van langzaam groeiende
bacteriën zoals bv. de tuberkelbacterie en obligaat anaërobe bacteriën
moet een andere methode bv. de agarverdunningsmethode worden
gebruikt.
De minimum remmende concentratie
, De minimum remmende concentratie (MRC of MIC = minimal inhibition
concentration) is de laagste concentratie van een anti-microbieel middel
waarbij een micro-organisme geremd wordt in zijn groei. De MRC voor een
micro-organisme wordt als volgt bepaald. In een serie buizen of in de cups
van een microtiterplaten, maakt men een verdunningsreeks van het anti-
microbiële middel in een vloeibaar medium, zodat men een afnemende
concentratie van dat middel in serie verkrijgt. In elk van de buizen ent
men dezelfde hoeveelheid van de te onderzoeken bacteriestam. Na 18 uur
incubatie stelt men vast in welke buizen het medium helder is (waarin dus
de bacteriestam niet macroscopisch zichtbaar is gegroeid) en in welke
buizen het medium troebel is (waarin de bacteriestam wel is gegroeid). De
heldere buis die voorafgaat aan de eerste buis met troebel medium bevat
de concentratie waarbij de bacterie geremd wordt. Dit is de MRC van het
antibioticum t.o.v. de bacteriestam die uitgedrukt wordt in microgrammen
per milliliter (µg/ml).
De minimum dodende concentratie
In dezelfde reeks buizen kan men ook de minimale concentratie, die de
bacteriestam gedood heeft, vaststellen. Hiertoe ent men de inhoud van de
heldere buizen van de reeks op een vast medium, bijvoorbeeld een
bloedplaat, en neemt na 18 uur incubatie waarop welk van de platen groei
van de bacteriestam is ontstaan. De laatste onbegroeide plaat van de
reeks is beent vanuit de buis die de concentratie anti-microbieel middel
bevat waarbij de bacterie gedood wordt. Dit is de MBC (minimal
bactericidal concentration) van het antibioticum t.o.v. de bacteriestam,
eveneens uitgedrukt in µg/ml. Hoe lager dus de MRC en de MBC van een
anti-microbieel middel voor een micro-organisme, hoe lager ook de
therapeutische dosis van het middel kan zijn.
PCR 16s rRNA genen
Materiaal en methode.
Biochemische testen.
Uit de agar platen en gramkleuring is gebleken dat er bij urine monster 30
waarschijnlijk een gram positieve coccen aanwezig zijn. Dit bleek uit de
groei op de CNA plaat, ook door de blauwe bacterie kolonies op de UTI
plaat, dit wijst op beta-glucosidase enzym activiteit, wat wijst op
enterococci bacterie. Ook uit de gramkleuring waren er gram positieve
coccen te zien in druiventros formatie. Om te bevestigen dat deze bacterie
enterococcen zijn worden de volgende testen uitgevoerd: Katalase test, Bile-
esculin hydrolyse; Sorbitol, arabinose, trehalose en mannitol test. Stel
