Les 1&2: Amplificatie technieken voor de detectie van
micro-organismen
Heeft kennis en begrip van synthese, en structuur van nucleinezuren
Purine: Adenine en Guanine
Pyrimidine: Thymine en Cytosine
Tussen C en G 3 waterstofbruggen en tussen A en T 2 waterstofbruggen
Kan de verschillende componenten van een PCR mix benoemen
Voor PCR heb je een dubbelstrengs nodig. Bij RNA kun je dit doen door reverse transcriptase en
dan maak je cDNA. Dit genetische materiaal kan soort specifiek zijn (16s rRNA gen of virulente
factoren), familie-specifiek (huishoud genen), resistente genen, hele genoom.
Verder heb je nodig: primers, (taq) polymerase, dNTPs, buffer, MgCl2 (essentiële co-factor voor
Taq- en heeft stabiliserend effect).
Informatie sequence: Bevat het DNA of RNA? Wat moet de sequentie van de primers zijn?
Taq-DNA polymerase
Hittestabiel, snelle synthese, gevoelig voor remmende stoffen. Géén 3'-5'exonucleoase
activiteit, dus géén proofreading.
Van 3’-5’ werking
Polymerase remmers
Proteolytische enzymen (pronase, proteinase K), Heparine, ijzerionen porfyrine-skeletten
(bloed), DMSO (hoge concentratie), Urinecomponenten en hoge zoutconcentraties, SDS,
Ureum. Dus belangrijk dat de zuivering goed en netjes gaat!
Herkent sense en anti-sense sequenties
Het genetisch materiaal is sense als een RNA-versie van dezelfde sequentie wordt vertaald naar
een eiwit, en ze noemen het complement ervan antisense. Sense is van 5-3 en antisense van 3-5.
Kent de voorwaarden waar een primer/probe aan moeten voldoen en welke factoren er van
belang zijn tijdens het ontwerpen van de primers/probes
Primers
18-25 nucleotiden (te lang zorgt voor hoge annealingtemperatuur en specificiteit)
Per paar een vergelijkbaar GC gehalte (annealing temperatuur)
Géén baseparing mogelijk in de primer zelf of tussen de twee primers (primer-dimeer)
Smeltemperatur (Tm) tussen ca 50ºC and 65ºC
Tm: Temperatuur waarbij 50% base paren gescheiden zijn.
Amplicon b.v.k. 75–200 bp. Hoogste efficientie.
Forward primer bindt aan de 3’-5’ en reverse primer aan de 5’-3’
Begrijpt het principe van DNA bindende stoffen
SYBR green
Het is een DNA bindende stof. Fluoresceert alleen wanneer het gebonden is aan dsDNA.
Inhibeert ook DNA amplificatie: dus concentratie kritisch en niet ideaal voor multiplex.
Gebruikt voor kwantitatieve analyse en smeltcurves.
Voordelen: relatief goedkoop, vereist geen probe ontwerp
Nadelen: bindt aan elk dsDNA, dus detecteert specifieke en aspecifieke dsDNA moleculen,
inclusief primer interacties. niet afgestemd op complexe protocollen
Taqman probe
Het is een hydrolyserende probe. vereist een sequentie-specifieke probe die fluorofoor en
quencher verbindt. Maakt gebruik van FRET. De probe moet eerder aan het DNA binden dan
, de primer, dus een relatief hoge Tm hebben. Hij mag geen G aan de 5’ kant hebben, dit zit in
de weg tijdens het sequencen. De polymerase moet een 5'-exonuclease activiteit hebben.
5' fluorescerent reporter - 3' quencher
Intact: reporter is “gedoofd” door nabijheid quencher.
Annealing: probe en primers hybridiseren aan target
Extensie primers: 5'—> 3' exonuclease activiteit Taq or Tth klieft probe
Signaal: maat voor hoeveelheid gevormd product in het monster.
Een smeltcurve analyse (hieronder uitgelegd) is niet nuttig, aangezien de fluorescentie blijft.
Voordelen: specificiteit, verschillende kleuren kunnen worden gebruikt in multiplex-assays.
Nadelen: wat achtergrondgeluid vanwege omkeerbaarheid van de reactie
Begrijpt het principe van real time PCR
Amplificatie en detectie zijn gecombineerd. Je detecteert de kwantificering van een fluorescente
reporter.
Tussentijds kijken naar de signalen (real time), maar niet volledige real time omdat je een tijd
instelt wanneer het apparaat de fluorescentie meet.
Achteraf doe je vaak een smeltcurve analyse om te kijken of de juiste fragmenten zijn
geamplificeerd. De smelttemperatuur is afhankelijk van samenstelling en lengte van het product.
Bij een aspecifiek product of primer dimers krijg je twee pieken te zien bij de smeltcurve ipv 1. Bij
multiplex is het juist de bedoeling dat je verschillende smelttemperaturen hebt.
Voordelen
Snelle verwerking: cycling times ≤1,5 uur
Hoge sample throughput (~200 monsters/dag)
Gevoelig (1 kopie van het gen, detecteert kleinere verschillen tussen samples)
Mogelijkheid om te kwantificeren, Grote dynamische range (10-10 10), Reproduceerbaar (CV <
2.0 %), Laag contaminatie risico (gesloten systeem), Flexibele proefopzetten, Multiplex
mogelijk (meerdere targets per PCR reactie), Software gestuurd
Nadelen
Niet ideaal voor multiplexing (maar wel degelijk mogelijk)
Set up: vereisten aan technische vaardigheden en kennis en investering in apparatuur
intra- and interassay variatie (andere dagen, andere personen)
RNA labiel en DNA contaminatie (bij mRNA analyse)
Minimaal 3 verschillende laboratorium ruimtes zijn nodig
Ruimte 1: Pipeteer mixen. Opslag mix materiaal (primer, buffer, enzym, Mg2+). Bovendruk
Ruimte 2: “vieze lab”. Patientenmonster verwerking (eventueel cDNA synthese), toevoegen
DNA (zowel alle interne controles), opslag patientenmateriaal. Onderdruk
Ruimte 3: PCR lab. Materialen in het PCR zetten. Resultaten ophalen (via PC)
Ruimte 4: Elektroforese. Onderdruk
Kent de relatie tussen het aantal cycli en de hoeveelheid DNA-amplimeren
In theorie is het product 2n cycli. Amplificatie is exponentieel, maar toename is gelimiteerd.
Real-Time PCR geeft mogelijkheid om de exponentionele fase te ‘zien’. o.b.v Ct berekenen met
hoeveel target materiaal je startte.
Ct-waarde: cyclusnummer waarbij signaal boven vastgestelde drempelwaarde komt. De
drempelwaarde moet gemeten worden in een exponentieel gebied en moet zo laag mogelijk zijn.
Kan een DNA alignment analyseren en interpreteren voor het ontwerpen van primers (m.b.v. bijv.
Primer3)
Ga nu naar NCBI genbank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) en zoek de sequentie met
het nummer KY604969.1. Controleer of de naam overeenkomt met:
, “Influenza A virus (A/chicken/Yuhuan/YH14/2016(H1N2)) segment 7 matrix protein 2 (M2) and
matrix protein 1 (M1) genes, complete cds”
Druk op de “Fasta” knop links boven in
Selecteer de sequentie en kopieer het naar een leeg word bestand
Open nu Primer3, http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/
Kopieer de doelsequentie (de virus sequentie) in het “Paste source sequence below” veld
Druk op pick primer
Kan het onderscheid benoemen voor moleculaire detectie van verschillende micro-organismen
(virussen, bacteriën)
Voor bacteriën gebruik je bijvoorbeeld 16S RNA en voor een virus sequenties van spike eiwitten.
Kent de diverse typen controles en het gebruik ervan (positieve, negatieve, interne controles en
endo-/exogene controle)
Blanco monsters.
steriel proefmonster Positieve controle. analyse goed uitgevoerd
Kwantitatief: controlemonster met bekende concentratie
Kwalitatief: besmettingsniveau van het controlemonster representatief voor de
aantoonbaarheidsgrens.
Negatieve controle:
Bekend monster zonder target (maar met DNA) van belang voor de kwaliteitscontrole en/of
selectiviteit (NTC = non-template controle)
Meervoudige waarnemingen
Minimaal in duplo (bij voorkeur triplo)
micro-organismen
Heeft kennis en begrip van synthese, en structuur van nucleinezuren
Purine: Adenine en Guanine
Pyrimidine: Thymine en Cytosine
Tussen C en G 3 waterstofbruggen en tussen A en T 2 waterstofbruggen
Kan de verschillende componenten van een PCR mix benoemen
Voor PCR heb je een dubbelstrengs nodig. Bij RNA kun je dit doen door reverse transcriptase en
dan maak je cDNA. Dit genetische materiaal kan soort specifiek zijn (16s rRNA gen of virulente
factoren), familie-specifiek (huishoud genen), resistente genen, hele genoom.
Verder heb je nodig: primers, (taq) polymerase, dNTPs, buffer, MgCl2 (essentiële co-factor voor
Taq- en heeft stabiliserend effect).
Informatie sequence: Bevat het DNA of RNA? Wat moet de sequentie van de primers zijn?
Taq-DNA polymerase
Hittestabiel, snelle synthese, gevoelig voor remmende stoffen. Géén 3'-5'exonucleoase
activiteit, dus géén proofreading.
Van 3’-5’ werking
Polymerase remmers
Proteolytische enzymen (pronase, proteinase K), Heparine, ijzerionen porfyrine-skeletten
(bloed), DMSO (hoge concentratie), Urinecomponenten en hoge zoutconcentraties, SDS,
Ureum. Dus belangrijk dat de zuivering goed en netjes gaat!
Herkent sense en anti-sense sequenties
Het genetisch materiaal is sense als een RNA-versie van dezelfde sequentie wordt vertaald naar
een eiwit, en ze noemen het complement ervan antisense. Sense is van 5-3 en antisense van 3-5.
Kent de voorwaarden waar een primer/probe aan moeten voldoen en welke factoren er van
belang zijn tijdens het ontwerpen van de primers/probes
Primers
18-25 nucleotiden (te lang zorgt voor hoge annealingtemperatuur en specificiteit)
Per paar een vergelijkbaar GC gehalte (annealing temperatuur)
Géén baseparing mogelijk in de primer zelf of tussen de twee primers (primer-dimeer)
Smeltemperatur (Tm) tussen ca 50ºC and 65ºC
Tm: Temperatuur waarbij 50% base paren gescheiden zijn.
Amplicon b.v.k. 75–200 bp. Hoogste efficientie.
Forward primer bindt aan de 3’-5’ en reverse primer aan de 5’-3’
Begrijpt het principe van DNA bindende stoffen
SYBR green
Het is een DNA bindende stof. Fluoresceert alleen wanneer het gebonden is aan dsDNA.
Inhibeert ook DNA amplificatie: dus concentratie kritisch en niet ideaal voor multiplex.
Gebruikt voor kwantitatieve analyse en smeltcurves.
Voordelen: relatief goedkoop, vereist geen probe ontwerp
Nadelen: bindt aan elk dsDNA, dus detecteert specifieke en aspecifieke dsDNA moleculen,
inclusief primer interacties. niet afgestemd op complexe protocollen
Taqman probe
Het is een hydrolyserende probe. vereist een sequentie-specifieke probe die fluorofoor en
quencher verbindt. Maakt gebruik van FRET. De probe moet eerder aan het DNA binden dan
, de primer, dus een relatief hoge Tm hebben. Hij mag geen G aan de 5’ kant hebben, dit zit in
de weg tijdens het sequencen. De polymerase moet een 5'-exonuclease activiteit hebben.
5' fluorescerent reporter - 3' quencher
Intact: reporter is “gedoofd” door nabijheid quencher.
Annealing: probe en primers hybridiseren aan target
Extensie primers: 5'—> 3' exonuclease activiteit Taq or Tth klieft probe
Signaal: maat voor hoeveelheid gevormd product in het monster.
Een smeltcurve analyse (hieronder uitgelegd) is niet nuttig, aangezien de fluorescentie blijft.
Voordelen: specificiteit, verschillende kleuren kunnen worden gebruikt in multiplex-assays.
Nadelen: wat achtergrondgeluid vanwege omkeerbaarheid van de reactie
Begrijpt het principe van real time PCR
Amplificatie en detectie zijn gecombineerd. Je detecteert de kwantificering van een fluorescente
reporter.
Tussentijds kijken naar de signalen (real time), maar niet volledige real time omdat je een tijd
instelt wanneer het apparaat de fluorescentie meet.
Achteraf doe je vaak een smeltcurve analyse om te kijken of de juiste fragmenten zijn
geamplificeerd. De smelttemperatuur is afhankelijk van samenstelling en lengte van het product.
Bij een aspecifiek product of primer dimers krijg je twee pieken te zien bij de smeltcurve ipv 1. Bij
multiplex is het juist de bedoeling dat je verschillende smelttemperaturen hebt.
Voordelen
Snelle verwerking: cycling times ≤1,5 uur
Hoge sample throughput (~200 monsters/dag)
Gevoelig (1 kopie van het gen, detecteert kleinere verschillen tussen samples)
Mogelijkheid om te kwantificeren, Grote dynamische range (10-10 10), Reproduceerbaar (CV <
2.0 %), Laag contaminatie risico (gesloten systeem), Flexibele proefopzetten, Multiplex
mogelijk (meerdere targets per PCR reactie), Software gestuurd
Nadelen
Niet ideaal voor multiplexing (maar wel degelijk mogelijk)
Set up: vereisten aan technische vaardigheden en kennis en investering in apparatuur
intra- and interassay variatie (andere dagen, andere personen)
RNA labiel en DNA contaminatie (bij mRNA analyse)
Minimaal 3 verschillende laboratorium ruimtes zijn nodig
Ruimte 1: Pipeteer mixen. Opslag mix materiaal (primer, buffer, enzym, Mg2+). Bovendruk
Ruimte 2: “vieze lab”. Patientenmonster verwerking (eventueel cDNA synthese), toevoegen
DNA (zowel alle interne controles), opslag patientenmateriaal. Onderdruk
Ruimte 3: PCR lab. Materialen in het PCR zetten. Resultaten ophalen (via PC)
Ruimte 4: Elektroforese. Onderdruk
Kent de relatie tussen het aantal cycli en de hoeveelheid DNA-amplimeren
In theorie is het product 2n cycli. Amplificatie is exponentieel, maar toename is gelimiteerd.
Real-Time PCR geeft mogelijkheid om de exponentionele fase te ‘zien’. o.b.v Ct berekenen met
hoeveel target materiaal je startte.
Ct-waarde: cyclusnummer waarbij signaal boven vastgestelde drempelwaarde komt. De
drempelwaarde moet gemeten worden in een exponentieel gebied en moet zo laag mogelijk zijn.
Kan een DNA alignment analyseren en interpreteren voor het ontwerpen van primers (m.b.v. bijv.
Primer3)
Ga nu naar NCBI genbank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) en zoek de sequentie met
het nummer KY604969.1. Controleer of de naam overeenkomt met:
, “Influenza A virus (A/chicken/Yuhuan/YH14/2016(H1N2)) segment 7 matrix protein 2 (M2) and
matrix protein 1 (M1) genes, complete cds”
Druk op de “Fasta” knop links boven in
Selecteer de sequentie en kopieer het naar een leeg word bestand
Open nu Primer3, http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/
Kopieer de doelsequentie (de virus sequentie) in het “Paste source sequence below” veld
Druk op pick primer
Kan het onderscheid benoemen voor moleculaire detectie van verschillende micro-organismen
(virussen, bacteriën)
Voor bacteriën gebruik je bijvoorbeeld 16S RNA en voor een virus sequenties van spike eiwitten.
Kent de diverse typen controles en het gebruik ervan (positieve, negatieve, interne controles en
endo-/exogene controle)
Blanco monsters.
steriel proefmonster Positieve controle. analyse goed uitgevoerd
Kwantitatief: controlemonster met bekende concentratie
Kwalitatief: besmettingsniveau van het controlemonster representatief voor de
aantoonbaarheidsgrens.
Negatieve controle:
Bekend monster zonder target (maar met DNA) van belang voor de kwaliteitscontrole en/of
selectiviteit (NTC = non-template controle)
Meervoudige waarnemingen
Minimaal in duplo (bij voorkeur triplo)
