Definieer de term flowcytometrie.
FLOW: fluid, maakt hydrodynamische focussering mogelijk door de celsuspensie in een
laminaire geleidingsvloeistof te injecteren. De hydrostatische druk in de celsuspensie
vergroot en de cellen 1 voor 1 naar de laser worden getransporteerd.
Voorwaarden
o Laminaire geleidingsvloeistof: bepaald door de formule van reynolds dpv/n
o Groter dan 2300 turbulent
o Kleiner dan 2300 laminair
CYTO, cellen worden 1 voor 1 voorbij de laser getransporteerd en gemeten
Voorwaarden
o Cellen moeten een grootte hebben tussen 0,2 µm en 150 µm
o Moeten zich in een single cel suspensie bevinden
o Tumoren bv eerst nog uit aggregatische toestand halen
o Desaggregatie kan enzymatisch door collegenase of mechanisch en filter
METRIE, meten, elke cel die bestraald wordt met de laser, zendt een lichpuls uit waaruit we
info kunnen halen.
Beschrijf welk type biologisch staal het meest geschikt is voor een flowcytometriche analyse.
Een bloedstaal is het meest geschikt voor een flowcytometrische analyse omdat de cellen
zich al in een single cell suspensie bevinden. Bovendien geschikte grootte Vb leukocyten
Een tumor daarentegen bevindt zich in een geaggregeerde toestand en moet men
deaggregeren dmv enzymen of mechanisch filteren.
Beschrijf welke kenmerken van een cel of partikel door een flowcytometerkunnen gemeten
worden (= optische vingerafdruk).
1. Relatieve grootte
Dit wordt gemeten adhv de forward scatter (FSC), onderdeel elastische component
van de lichtpuls. De lichtpuls die wordt gegenereerd in de as van de laser. Een
flowcytometer kan de grootte range bepalen van cellen tussen de 0,2 en 150 µm.
2. Relatieve complexiteit/granulariteit
De interne complexiteit (granules, kern,..) en externe complexiteit (onregelmatig
celmembraan, membraanantigenen,…) kan bepaald worden door de side scatter
(SSC), onderdeel elastische component van de lichtpuls. Deze ligt ongeveer 90° van
de lasterstraal.
3. Relatieve fluorescentie intensiteit
Deze wordt bepaald door de niet elastische component van de lichtpuls.
Identificeer de 3 componenten (= hoofdonderdelen) van een flowcytometer(fluidica, optica
en electronica) en beschrijf hun respectievelijke functies
Fluidica: Door hydrodynamische focussering worden de cellen 1 voor 1 naar de laser
getransporteerd. Dit komt doordat de laminaire geleidingsvloeistof voor een hogere druk in
de celsuspensie zorgt, waardoor de cellen 1 voor 1 in een smalle lijn naar de laser worden
gevoerd.
Optica: Detecteert de lichtpulsen die de cellen uitzenden nadat ze werden aangestraald door
de laser. Men heeft excitatie (van aangeslagen toestand naar grondtoestand) dat men kan
opdelen in elastische en niet elastische componenten. (uitleg kijk andere vraag). Deze
lichtpulsen gaan me capteren en detecteren door lenzen. Dmv dichroische en
banddoorlatende filters zal men de lichtpulsen opdelen in 7 verschillende golflengte
, gebieden. Verder wordt de lichtpuls nog verder verwerkt door PMT (photo multiplier tubes)
die van de fotonen een cascade van é zal teweegbrengen.
Elektronica
De gegeven stroompulsen worden verder verwerkt en gedigitaliseerd. Eerst wordt er een
elektronische verwerking gedaan. Met een lineaire of logaritmische versterking. Daarna gaat
men de gegevens digitaliseren mbv ADC analoog digitale conversie en resolutie dmv MCA
(multikanaals analysen). Finale waarden worden naar de computer gestuurd.
Verklaar hydrodynamische focusering
Hydrodynamische focussering wordt mogelijk gemaakt doordat een celsuspensie wordt
geïnjecteerd in een laminaire geleidingsvloeistof. Hierdoor vergroot de druk in de
celsuspensie en zullen de cellen 1 voor 1 in een smalle lijn getransporteerd worden naar de
laser.
Beschrijf elastische en niet-elastische lichtverstrooiing
Elastische lichtverstrooiing
= de eigenlijke verstrooiing
Golflengte van emissie = golflengte excitatie
=>behoud van energie
Licht op grensvlak tussen 2 niveaus
-De fraunhofer diffractie (FSC)
Hoe meer FFC hoe groter de cel
-De side scatter
Hoe meer side scatter hoe groter de complexiteit is van de cel
Niet elastische lichtverstrooiing
= fluorescentie
Golflengte emissie groter dan de golflengte excitatie
Geen behoud van energie
Licht valt in op probes thv chromofore groepen die gekenmerkt worden met dezelfde
golflengte absorptie maar verschillende golflengte emissie. Zenden licht uit met lagere
energie inhoud.
Soorten fluorescentie
Autofluorescentie
Specifieke fluorescentie
immunospecieke fluorescentie probes
Beschrijf het gebruik van excitatie- en emissiespectra
Belangrijk om te weten voor welke filters men moet gebruiken.
Herken verschillende manieren om flowcytometrische data voor te stellen
Histogram 1 parameter
Density plot 2 parameters
Dot plot 2 parameters
Contour plot
Beschrijf het doel van cel- (of partikel-) sortering
Het doel is om een flowcytometrisch gekarakteriseerde cel met een 100 procent zuiverheid te
isoleren uit een celsuspensie.
FLOW: fluid, maakt hydrodynamische focussering mogelijk door de celsuspensie in een
laminaire geleidingsvloeistof te injecteren. De hydrostatische druk in de celsuspensie
vergroot en de cellen 1 voor 1 naar de laser worden getransporteerd.
Voorwaarden
o Laminaire geleidingsvloeistof: bepaald door de formule van reynolds dpv/n
o Groter dan 2300 turbulent
o Kleiner dan 2300 laminair
CYTO, cellen worden 1 voor 1 voorbij de laser getransporteerd en gemeten
Voorwaarden
o Cellen moeten een grootte hebben tussen 0,2 µm en 150 µm
o Moeten zich in een single cel suspensie bevinden
o Tumoren bv eerst nog uit aggregatische toestand halen
o Desaggregatie kan enzymatisch door collegenase of mechanisch en filter
METRIE, meten, elke cel die bestraald wordt met de laser, zendt een lichpuls uit waaruit we
info kunnen halen.
Beschrijf welk type biologisch staal het meest geschikt is voor een flowcytometriche analyse.
Een bloedstaal is het meest geschikt voor een flowcytometrische analyse omdat de cellen
zich al in een single cell suspensie bevinden. Bovendien geschikte grootte Vb leukocyten
Een tumor daarentegen bevindt zich in een geaggregeerde toestand en moet men
deaggregeren dmv enzymen of mechanisch filteren.
Beschrijf welke kenmerken van een cel of partikel door een flowcytometerkunnen gemeten
worden (= optische vingerafdruk).
1. Relatieve grootte
Dit wordt gemeten adhv de forward scatter (FSC), onderdeel elastische component
van de lichtpuls. De lichtpuls die wordt gegenereerd in de as van de laser. Een
flowcytometer kan de grootte range bepalen van cellen tussen de 0,2 en 150 µm.
2. Relatieve complexiteit/granulariteit
De interne complexiteit (granules, kern,..) en externe complexiteit (onregelmatig
celmembraan, membraanantigenen,…) kan bepaald worden door de side scatter
(SSC), onderdeel elastische component van de lichtpuls. Deze ligt ongeveer 90° van
de lasterstraal.
3. Relatieve fluorescentie intensiteit
Deze wordt bepaald door de niet elastische component van de lichtpuls.
Identificeer de 3 componenten (= hoofdonderdelen) van een flowcytometer(fluidica, optica
en electronica) en beschrijf hun respectievelijke functies
Fluidica: Door hydrodynamische focussering worden de cellen 1 voor 1 naar de laser
getransporteerd. Dit komt doordat de laminaire geleidingsvloeistof voor een hogere druk in
de celsuspensie zorgt, waardoor de cellen 1 voor 1 in een smalle lijn naar de laser worden
gevoerd.
Optica: Detecteert de lichtpulsen die de cellen uitzenden nadat ze werden aangestraald door
de laser. Men heeft excitatie (van aangeslagen toestand naar grondtoestand) dat men kan
opdelen in elastische en niet elastische componenten. (uitleg kijk andere vraag). Deze
lichtpulsen gaan me capteren en detecteren door lenzen. Dmv dichroische en
banddoorlatende filters zal men de lichtpulsen opdelen in 7 verschillende golflengte
, gebieden. Verder wordt de lichtpuls nog verder verwerkt door PMT (photo multiplier tubes)
die van de fotonen een cascade van é zal teweegbrengen.
Elektronica
De gegeven stroompulsen worden verder verwerkt en gedigitaliseerd. Eerst wordt er een
elektronische verwerking gedaan. Met een lineaire of logaritmische versterking. Daarna gaat
men de gegevens digitaliseren mbv ADC analoog digitale conversie en resolutie dmv MCA
(multikanaals analysen). Finale waarden worden naar de computer gestuurd.
Verklaar hydrodynamische focusering
Hydrodynamische focussering wordt mogelijk gemaakt doordat een celsuspensie wordt
geïnjecteerd in een laminaire geleidingsvloeistof. Hierdoor vergroot de druk in de
celsuspensie en zullen de cellen 1 voor 1 in een smalle lijn getransporteerd worden naar de
laser.
Beschrijf elastische en niet-elastische lichtverstrooiing
Elastische lichtverstrooiing
= de eigenlijke verstrooiing
Golflengte van emissie = golflengte excitatie
=>behoud van energie
Licht op grensvlak tussen 2 niveaus
-De fraunhofer diffractie (FSC)
Hoe meer FFC hoe groter de cel
-De side scatter
Hoe meer side scatter hoe groter de complexiteit is van de cel
Niet elastische lichtverstrooiing
= fluorescentie
Golflengte emissie groter dan de golflengte excitatie
Geen behoud van energie
Licht valt in op probes thv chromofore groepen die gekenmerkt worden met dezelfde
golflengte absorptie maar verschillende golflengte emissie. Zenden licht uit met lagere
energie inhoud.
Soorten fluorescentie
Autofluorescentie
Specifieke fluorescentie
immunospecieke fluorescentie probes
Beschrijf het gebruik van excitatie- en emissiespectra
Belangrijk om te weten voor welke filters men moet gebruiken.
Herken verschillende manieren om flowcytometrische data voor te stellen
Histogram 1 parameter
Density plot 2 parameters
Dot plot 2 parameters
Contour plot
Beschrijf het doel van cel- (of partikel-) sortering
Het doel is om een flowcytometrisch gekarakteriseerde cel met een 100 procent zuiverheid te
isoleren uit een celsuspensie.
