H1 - Inleiding
1 Kernthema’s
1) Van 1 molecule naar omnics (bv. 1 gen naar hele genoom) = nanopore sequencing,
next generation sequencing,…
2) Multiomnics = op meerder niveaus analyse
3) Van bulk naar single cell = Bulk: bv. heel weefselbiopt (heterogeen) meten (in de
blender) (Transcriptomics, Proteomics) geeft weinig inzicht terwijl bij single cell je per cel
analyses doet (bv. cellen met trypsine losmaken, elk in een droplet brengen en dit dan
onderzoeken).
4) Van single cell naar spatial omics = waar in ruimte bevindt zich iets? (niet enkel
informatie welke cellen er zich bevinden, maar ook op welke plek). Kan handig zijn voor
visualisatie op een biopt waar bepaalde cellen zitten met bepaalde kenmerken.
Meerkeuze (16
vragen): 8/20
Open vragen (4): 8/20
Mondeling: 4/20
5) Interactomics = interactienetwerken bekijken/onderzoeken
Methoden 3 = beetje meerkeuze (detailvragen -> enkel over methoden 3), open vragen (gaan ook gaan over
methoden 3) en mondeling vraag (gaat specifiek over heel de cursus -> 10/15 min uitleggen)(beoordeeld enkel wat
je zegt)(stel je bent fout, polst hij nog over een andere oplossing)
Mondeling: probleem oplossen. Gaat over algemene kennis. Bv. ziekte om mitochondriale afwijking te bekijken,
hebben dit via fluorescentie microscopie geprobeert maar lukt niet. -> kunt zeggen kan via superresolutie
microscopie -> voorbeeld (+ principe)
Staal waar je DNA sequentie wilt doen -> hoe doe je dit? Extraheren (hoe?)
Mondeling is minder dan kwart van de punten.
,H2 – DNA en genomics
1 DNA sequentiebepaling
1.1 Inleiding
1st generation (Sanger) = kloneren (plasmide) in bacterie (nu PCR) en elektroforese ->
gouden standaard voor kleine projecten maar voor grote duurt het te lang. Bv.
2nd generation (Illumina, Ion Torrent) = massief parallel sequencen (miljoenen
verschillende kleine sequenties in 1 keer) van klonaal in vitro geamplificeerde DNA
moleculen (dus zonder bacterie). Dit is sneller en goedkoper. Nadelen = korte sequenties
+ bij sommige toestellen is accuraatheid een probleem (moeilijker voor mutaties).
3rd generation (Nanopore, Pacific Biosciences) = geen amplificatie vereist (lange
sequentie/single molecule sequencen). Amplificatie is niet altijd even juist dus dit
elimineert deze factor. Is sneller en goedkoper.
Toepassingen:
- De novo genoom sequentiebepaling (eerste keer/nieuwe sequentie gedeeltelijk of
volledig sequeneren, bv. COVID). Nadeel = kleine sequence stukjes moet je aan elkaar
hangen (computer kijkt naar overlappende eindjes) maar daar zitten gewoonlijk gaten in.
- Resequencing = sequentie van een nieuwe individu/patiënt op referentiegenoom
mappen (SNP’s, mutaties, diagnose, NIPT voor chromosomale afwijkingen kind).
Voordeel = makkelijk om kleine sequence stukjes op het volledig genoom te mappen.
- Sequentiebepaling als teller = aantallen DNA/RNA moleculen (bv. hoeveel keer komt
een gen tot expressie -> hoeveel RNA bv. RNAseq)
=> WGS (whole-genome sequencing), WES (whole-exome sequencing -> enkel
interesse in coderende sequentie wat 1,5% is van genoom = tijdswinnend) of targeted
sequencing (specifieke gewenste regio’s). Transcriptoom: RNA -> cDNA (interesse in
RNA sequentie).
1.2 1ste generation sequencing
Had impact op biologische kennis (sequentie en organisatie van bijna alle humane genen
gekend, inzicht in de evolutie, genetische verschillen tussen de mens,…) en ontwikkeling
bioinformatica. Mogelijkheden voor personalized precision medicine (therapie op
maat bij kanker bv., inzicht in complexe aandoeningen zoals diabetes en kanker,
verklaren en voorspellen of bepaalde individuen goed/slecht reageren op een GM ->
farma-industrie, kennis van volgorde en SNP’s helpt in de diagnose/prognose/preventie).
,H2 – DNA en genomics
1.2.1 Sanger sequencing
= nieuwsynthese met dideoxy-keten terminatie -> template (DNA sequentie) is een
gefragmenteerd genoom dat geamplificeerd wordt (klassiek kloneren in bacteriën of
PCR).
Tijdens amplificatie = polymerase (thermostabiel en kunnen zowel d als dd inbouwen) +
primer + 4 DNTP’s en ddNTP’s (elk met verschillend fluorescent label, missen 3’ OH
groep welke de fosfodiesterverbinding normaal maakt in DNA keten). Reactie van keten
stopt na inbouwen ddNTP. Verschillende lengtes worden gescheiden op gel/cappilair
(eerste de kleine fragmenten) -> elektroferogram. Eerste 30bp niet afleesbaar, beperkt
tot 500-1000 bp + moeite aflezen van regio’s met herhalingen of GC-rijke regio’s
(plakken sterk aan elkaar door 3 bindingen dus moeilijker te interpreteren) = overlap.
Software leest dit af met kwaliteitsscores (Phred-score, moet min. 20 zijn anders is de
waarschijnlijkheid dat je een foutieve base afleest te hoog -> overlap). Hoe hoger de
score hoe lager de kans. Voor betrouwbaarheid = 2 aparte reacties met FW en RV primer
om beide richtingen te lezen.
N -> te lage betrouwbaarheid dus computer kan geen juiste
letter toegeven. Oplossing = FW of RV sequentie nemen.
Wordt ook gebruikt om mutaties te detecteren (2 piekjes, soms is dit ook een
sequentiefout -> reverse bekijken of dit daar ook is).
Nadeel = lage throughput (aantal reads per dag) en hoge kosten.
1.3 2nd generation sequencing: short-read NGS
Doel = veel hogere throughput (massale DNA sequentiebepaling mogelijk -> 1 humaan
genoom op 1 toestel/dag) en veel lagere kosten:
- Parallelle detectie = klonale in vitro amplificatie van een korte template ->
duizende/miljoenen kopieën van DNA template per cluster. Multiplexing = vele clusters
tegelijk (veel templates/reactie ivm. 1 template/reactie).
- Miniaturisatie van reacties (minder kosten)
- Integratie van het proces -> directe detectie (ivm. scheiding via gelektroforese)
Voorbeelden = Roche, Illumina, Ion Torrent,…
1 Kernthema’s
1) Van 1 molecule naar omnics (bv. 1 gen naar hele genoom) = nanopore sequencing,
next generation sequencing,…
2) Multiomnics = op meerder niveaus analyse
3) Van bulk naar single cell = Bulk: bv. heel weefselbiopt (heterogeen) meten (in de
blender) (Transcriptomics, Proteomics) geeft weinig inzicht terwijl bij single cell je per cel
analyses doet (bv. cellen met trypsine losmaken, elk in een droplet brengen en dit dan
onderzoeken).
4) Van single cell naar spatial omics = waar in ruimte bevindt zich iets? (niet enkel
informatie welke cellen er zich bevinden, maar ook op welke plek). Kan handig zijn voor
visualisatie op een biopt waar bepaalde cellen zitten met bepaalde kenmerken.
Meerkeuze (16
vragen): 8/20
Open vragen (4): 8/20
Mondeling: 4/20
5) Interactomics = interactienetwerken bekijken/onderzoeken
Methoden 3 = beetje meerkeuze (detailvragen -> enkel over methoden 3), open vragen (gaan ook gaan over
methoden 3) en mondeling vraag (gaat specifiek over heel de cursus -> 10/15 min uitleggen)(beoordeeld enkel wat
je zegt)(stel je bent fout, polst hij nog over een andere oplossing)
Mondeling: probleem oplossen. Gaat over algemene kennis. Bv. ziekte om mitochondriale afwijking te bekijken,
hebben dit via fluorescentie microscopie geprobeert maar lukt niet. -> kunt zeggen kan via superresolutie
microscopie -> voorbeeld (+ principe)
Staal waar je DNA sequentie wilt doen -> hoe doe je dit? Extraheren (hoe?)
Mondeling is minder dan kwart van de punten.
,H2 – DNA en genomics
1 DNA sequentiebepaling
1.1 Inleiding
1st generation (Sanger) = kloneren (plasmide) in bacterie (nu PCR) en elektroforese ->
gouden standaard voor kleine projecten maar voor grote duurt het te lang. Bv.
2nd generation (Illumina, Ion Torrent) = massief parallel sequencen (miljoenen
verschillende kleine sequenties in 1 keer) van klonaal in vitro geamplificeerde DNA
moleculen (dus zonder bacterie). Dit is sneller en goedkoper. Nadelen = korte sequenties
+ bij sommige toestellen is accuraatheid een probleem (moeilijker voor mutaties).
3rd generation (Nanopore, Pacific Biosciences) = geen amplificatie vereist (lange
sequentie/single molecule sequencen). Amplificatie is niet altijd even juist dus dit
elimineert deze factor. Is sneller en goedkoper.
Toepassingen:
- De novo genoom sequentiebepaling (eerste keer/nieuwe sequentie gedeeltelijk of
volledig sequeneren, bv. COVID). Nadeel = kleine sequence stukjes moet je aan elkaar
hangen (computer kijkt naar overlappende eindjes) maar daar zitten gewoonlijk gaten in.
- Resequencing = sequentie van een nieuwe individu/patiënt op referentiegenoom
mappen (SNP’s, mutaties, diagnose, NIPT voor chromosomale afwijkingen kind).
Voordeel = makkelijk om kleine sequence stukjes op het volledig genoom te mappen.
- Sequentiebepaling als teller = aantallen DNA/RNA moleculen (bv. hoeveel keer komt
een gen tot expressie -> hoeveel RNA bv. RNAseq)
=> WGS (whole-genome sequencing), WES (whole-exome sequencing -> enkel
interesse in coderende sequentie wat 1,5% is van genoom = tijdswinnend) of targeted
sequencing (specifieke gewenste regio’s). Transcriptoom: RNA -> cDNA (interesse in
RNA sequentie).
1.2 1ste generation sequencing
Had impact op biologische kennis (sequentie en organisatie van bijna alle humane genen
gekend, inzicht in de evolutie, genetische verschillen tussen de mens,…) en ontwikkeling
bioinformatica. Mogelijkheden voor personalized precision medicine (therapie op
maat bij kanker bv., inzicht in complexe aandoeningen zoals diabetes en kanker,
verklaren en voorspellen of bepaalde individuen goed/slecht reageren op een GM ->
farma-industrie, kennis van volgorde en SNP’s helpt in de diagnose/prognose/preventie).
,H2 – DNA en genomics
1.2.1 Sanger sequencing
= nieuwsynthese met dideoxy-keten terminatie -> template (DNA sequentie) is een
gefragmenteerd genoom dat geamplificeerd wordt (klassiek kloneren in bacteriën of
PCR).
Tijdens amplificatie = polymerase (thermostabiel en kunnen zowel d als dd inbouwen) +
primer + 4 DNTP’s en ddNTP’s (elk met verschillend fluorescent label, missen 3’ OH
groep welke de fosfodiesterverbinding normaal maakt in DNA keten). Reactie van keten
stopt na inbouwen ddNTP. Verschillende lengtes worden gescheiden op gel/cappilair
(eerste de kleine fragmenten) -> elektroferogram. Eerste 30bp niet afleesbaar, beperkt
tot 500-1000 bp + moeite aflezen van regio’s met herhalingen of GC-rijke regio’s
(plakken sterk aan elkaar door 3 bindingen dus moeilijker te interpreteren) = overlap.
Software leest dit af met kwaliteitsscores (Phred-score, moet min. 20 zijn anders is de
waarschijnlijkheid dat je een foutieve base afleest te hoog -> overlap). Hoe hoger de
score hoe lager de kans. Voor betrouwbaarheid = 2 aparte reacties met FW en RV primer
om beide richtingen te lezen.
N -> te lage betrouwbaarheid dus computer kan geen juiste
letter toegeven. Oplossing = FW of RV sequentie nemen.
Wordt ook gebruikt om mutaties te detecteren (2 piekjes, soms is dit ook een
sequentiefout -> reverse bekijken of dit daar ook is).
Nadeel = lage throughput (aantal reads per dag) en hoge kosten.
1.3 2nd generation sequencing: short-read NGS
Doel = veel hogere throughput (massale DNA sequentiebepaling mogelijk -> 1 humaan
genoom op 1 toestel/dag) en veel lagere kosten:
- Parallelle detectie = klonale in vitro amplificatie van een korte template ->
duizende/miljoenen kopieën van DNA template per cluster. Multiplexing = vele clusters
tegelijk (veel templates/reactie ivm. 1 template/reactie).
- Miniaturisatie van reacties (minder kosten)
- Integratie van het proces -> directe detectie (ivm. scheiding via gelektroforese)
Voorbeelden = Roche, Illumina, Ion Torrent,…
